微生物技術(shù)水中大腸菌群的檢測

發(fā)布時間：

2022-11-16

作者：

國內(nèi)微生物培養(yǎng)基公司

水中大腸菌群的檢測

一,實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容

目的:學(xué)習(xí)檢測水中大腸菌群的方法,了解大腸菌群數(shù)量與水質(zhì)狀況的關(guān)系.

內(nèi)容:1.用濾膜法檢測大腸菌群.

2.用多管發(fā)酵法檢測大腸菌群.

二,實驗材料和用具

復(fù)紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(遠藤氏培養(yǎng)基),乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基,乳糖蛋白胨培養(yǎng)液,三倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)液,伊紅美藍培養(yǎng)基(EMB 培養(yǎng)基).

微孔濾膜(孔徑0.45µm),濾器(容量500毫升),抽氣設(shè)備,鑷子,發(fā)酵用試管,杜氏小管,培養(yǎng)皿,刻度吸管或移液管,接種環(huán),酒精燈.

三,操作步驟

(一)水樣的采集

1.自來水將自來水龍頭用火焰燒灼3分鐘滅菌,再擰開水龍頭流水5分鐘, 以排除管道內(nèi)積存的死水,隨后用已滅菌的三角瓶接取水樣,以供檢測.

2.池水,河水或湖水將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水層中,瓶口朝上,除去瓶塞,待水流入瓶中裝滿后,蓋好瓶塞,取出后立即進行檢測,或臨時存于冰箱,但不能超過24h.

(二)濾膜法檢測大腸菌群

l.用無菌鑷子將一無菌濾膜置于濾器的承受器當(dāng)中,將過濾杯裝于濾膜承受器上,旋緊,使接口處能密封,將真空泵與濾器下部的抽氣口連接(圖26-1).

2.加水樣100毫升于濾杯中,啟動抽真空系統(tǒng),使水通過濾膜流到下部,水中的菌細胞被截留在濾膜上.水樣用量可適當(dāng)增減使獲得菌落適量.

3.用無菌鑷子小心將截留有細菌的濾膜取出,平移貼于復(fù)紅亞硫酸鈉固體培養(yǎng)基上(注意無菌操作,濾膜與培養(yǎng)基間貼緊,無氣泡),37攝氏度培養(yǎng)16～l8h.挑選深紅色或紫紅色,帶有或不帶金屬光澤的菌落,或淡紅色,中心色較深的菌落進行涂片和革蘭氏染色觀察.

4.經(jīng)染色證實為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者,再接種在乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基上,37攝氏度培養(yǎng)6～8h后觀察,產(chǎn)氣者證實為大腸菌群陽性.培養(yǎng)中應(yīng)及時觀察,時間過長則氣泡可能消失.

5.結(jié)果計算

水樣中總大腸菌群數(shù)/個·L-1=(濾膜生長的菌落數(shù)/過濾水樣量/毫升)×100

(濾膜上菌落數(shù)以20～60個/片較為適宜)

(三)多管發(fā)酵法檢測大腸菌群

1.取5支裝有3倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管,每管分別加入水樣10毫升.另取5支裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管,每管分別加入水樣l毫升.再取5支裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管,每管分別加入按1:10稀釋的水樣l毫升(即相當(dāng)于原水樣0.1毫升),均貼好標(biāo)簽.此即為15管法,接種待測水樣量共計55.5毫升.各管搖勻后在37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)24h.

若待測水樣污染嚴(yán)重,可按上述3種梯度將水樣稀釋10倍(即分別接種原水樣1毫升,0.l毫升,0.01毫升),甚至100倍(即分別接種原水樣0.l毫升,0.01毫升,0.001毫升),以提高檢測的準(zhǔn)確度.此時,不必用3倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)基,全用乳糖蛋白胨培養(yǎng)基.

2.取出培養(yǎng)后的發(fā)酵管,觀察管內(nèi)發(fā)酵液顏色變?yōu)辄S色者記錄為產(chǎn)酸,杜氏小管內(nèi)有氣泡者記錄為產(chǎn)氣.將產(chǎn)酸產(chǎn)氣和只產(chǎn)酸的兩類發(fā)酵管分別劃線接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上,在37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)18～24h.挑選深紫黑色和紫黑色帶有或不帶有金屬光澤的菌落,或淡紫紅色和中心色較深的菌落,將其一部分分別取樣進行涂片和革蘭氏染色觀察.

3.經(jīng)鏡檢證實為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,則將此菌落的另一部分接種于裝有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的復(fù)發(fā)酵管中,每管可接種同一發(fā)酵管的典型菌落1～3個,37攝氏度培養(yǎng)24h若為產(chǎn)酸產(chǎn)氣者表明試管內(nèi)有大腸菌群菌存在,記錄為陽性管.

4.根據(jù)3個梯度(10毫升,1毫升,0.1毫升)每5支管中出現(xiàn)的陽性管教(即為數(shù)量指標(biāo)),查附注的“15管發(fā)酵法水中大腸菌群5次重復(fù)測數(shù)統(tǒng)計表”(表26-2)的細菌最可能數(shù),再乘以100即換算成1升水樣中的總大腸菌群數(shù).

四,注意事項

認真配制不同類型培養(yǎng)基.

檢測中應(yīng)合理控制所加的水樣量.

在濾膜法中每片濾膜的菌落數(shù)以20～60個為宜.多管發(fā)酵法中水樣稀釋比例要適宜.

挑選菌落時認真選擇大腸菌群典型菌落.

五,演示

1.具有大腸菌群的發(fā)酵管中產(chǎn)酸與產(chǎn)氣特征的觀察.

2.在復(fù)紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基上大腸菌群典型菌落的色澤及特征的識別.

六,實驗報告

(一)實驗結(jié)果記錄

1.微孔濾膜法

過濾水樣量(毫升):______ ,37攝氏度培養(yǎng)后特征菌落數(shù):______,接種乳糖培養(yǎng)基后的陽性管數(shù):______.