冷凍飲品中大腸埃希氏菌O157的檢測(cè)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
冷凍飲品中大腸埃希氏菌O157的檢測(cè)
一、儀器
干熱滅菌箱和濕熱滅菌器;培養(yǎng)箱;PH計(jì);無(wú)菌接種環(huán);移液器;磁性架;旋轉(zhuǎn)混合器;Direct-PureUP超純水系統(tǒng).
二、試劑
增菌液：mTSB+N(改良胰蛋白胨大豆肉湯mTSB+新生霉素溶液);CT-SMAC培養(yǎng)基;營(yíng)養(yǎng)瓊脂;胰蛋白胨培養(yǎng)基;吲哚反應(yīng)培養(yǎng)基;抗大腸埃希氏菌O157免疫磁珠;改良蛋白胨緩沖液,0.01mol/L,PH7.2;生理鹽水;Kovac's靛基質(zhì)試劑;大腸埃希氏菌O157抗血清.
三、實(shí)驗(yàn)方法
取樣:取(x)g或是(x)毫升樣品加入9(x)g或是9(x)毫升mTSB+N增菌液中,于41.5培養(yǎng),最后的樣品與mTSB+N體積比為1:10.
增菌:將上述增菌液于41.5培養(yǎng)6h,隨后再培養(yǎng)12-18h,總計(jì)培養(yǎng)18-24h.6h培養(yǎng)后進(jìn)行隨后的免疫技術(shù)分離以及選擇性培養(yǎng)基上接種得到的假陽(yáng)性結(jié)果在18h培養(yǎng)后可能得到的是陰性結(jié)果.
免疫磁珠分離(IMS):混合增菌液,將食物的殘?jiān)鼦壢?
取一個(gè)離心管,加入20μL已準(zhǔn)備好的平衡到室溫的免疫磁珠微粒.取1毫升增菌液的上清液,避免吸入實(shí)物雜質(zhì)或是脂肪加入到離心管中.在旋轉(zhuǎn)混合器上以12-20r/分鐘的速率將混懸液混合10分鐘.把離心管放置在磁性架上,將磁珠聚集起來(lái),確保避免磁珠微粒吸附在管壁上.打開(kāi)管蓋(離心管保持在磁性架上),使用無(wú)菌巴斯德吸管把液體從管子的底部慢慢吸起來(lái),每個(gè)樣品均使用一個(gè)新的吸管.加入1毫升無(wú)菌緩沖清洗液蓋上管蓋,將離心管從磁性架上取下,正反顛倒混勻后放回磁性架.
重復(fù)上述清洗過(guò)程數(shù)次.
最后加入100μL無(wú)菌緩沖清洗液使磁珠重新懸浮,然后從磁性架上取下.
接種:吸取50μL懸浮液接種到預(yù)先干燥的CT-SMAC上,使用無(wú)菌接種環(huán)劃線以得到分離良好的單菌落.37培養(yǎng)18-24h.在CT-SMAC平板上,典型菌落形態(tài)為透明或是接近無(wú)色,菌落周?chē)霈F(xiàn)黃棕色,菌落直徑為1毫米.
確診
選擇菌落:每塊平板上選擇5個(gè)典型菌落,如果典型菌落少于5個(gè)則全部選擇.將典型菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上分離純化.37培養(yǎng)18-24h.需選用純菌落進(jìn)行鑒定.
生化鑒定：吲哚反應(yīng)
挑取一個(gè)純化的單菌落于胰蛋白胨培養(yǎng)基中.37培養(yǎng)24h.加入1毫升Kovac's靛基質(zhì)試劑,室溫下放置10分鐘.出現(xiàn)紅色環(huán)為陽(yáng)性反應(yīng),出現(xiàn)黃色環(huán)為陰性反應(yīng).
血清確診:只有吲哚反應(yīng)陽(yáng)性的菌落需要進(jìn)行大腸埃希氏菌O157血清反應(yīng).
滴一滴生理鹽水在一塊干凈的玻片上,用接種環(huán)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上挑取一個(gè)菌落于生理鹽水上,使菌落在生理鹽水里均勻分散,晃動(dòng)玻片30-60s,在黑色背景下進(jìn)行觀察.如果菌懸液形成塊狀,則該菌株是自動(dòng)凝集菌株,不能進(jìn)行特定抗血清的測(cè)試.
挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的純菌落在玻片上,懸浮于生理鹽水中,滴加一滴大腸埃希氏菌O157抗血清.如果在1分鐘內(nèi)出現(xiàn)凝集,則該反應(yīng)為陽(yáng)性.
菌落為吲哚陽(yáng)性,并滿足O157抗血清或是O157：H7抗血清陽(yáng)性.菌落即可鑒定為大腸埃希氏菌O157.
質(zhì)量控制
質(zhì)量控制菌株:從國(guó)家菌種保藏中心可以得到不具毒性的大腸埃希氏菌O157菌株,該菌株可以用于培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量控制.
培養(yǎng)方法:為了測(cè)試實(shí)驗(yàn)室能力以及按照該國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)描述的測(cè)試方法測(cè)試培養(yǎng)基對(duì)于低含量的大腸埃希氏菌O157的檢出能力,準(zhǔn)備一個(gè)低濃度不含致病性的大腸埃希氏菌O157參考樣品和一個(gè)添加大量其他大腸埃希氏菌的樣品進(jìn)行平行測(cè)試.
檢出限與報(bào)告限:按照結(jié)果解釋,在指定的質(zhì)量或是體積樣品中,根據(jù)本方法檢出或是未檢出大腸埃希氏菌O157.
在包括大腸埃希氏菌O157在內(nèi)的致病菌檢測(cè)及菌落總數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)基配制、試劑配制等步驟需要用到純水.RephiLe特別推薦Direct-PureUP一體化超純水系統(tǒng).Direct-PureUP是一款以自來(lái)水為進(jìn)水,同時(shí)生產(chǎn)RO純水和超純水的超純水系統(tǒng).Direct-PureUP生產(chǎn)的超純水經(jīng)雙波長(zhǎng)紫外燈殺菌并分解有機(jī)物、0.22μm終端濾器截留后,超純水中細(xì)菌含量小于1cfu/毫升,可以用來(lái)配制培養(yǎng)基和試劑溶液;RO純水可以用來(lái)清洗實(shí)驗(yàn)器皿及水浴.Direct-PureUP可以選配取水手柄,RephiLe獨(dú)有專(zhuān)利的取水內(nèi)置電阻率檢測(cè)儀,可以實(shí)時(shí)反映取水點(diǎn)的真實(shí)水質(zhì);手柄連線長(zhǎng)達(dá)3米,遠(yuǎn)程取水輕松自由,方便舒適.RephiLe還可以提供純水系統(tǒng)的驗(yàn)證服務(wù),幫助用戶完成符合ISO、GMP、GLP的系統(tǒng)驗(yàn)證,滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)于相關(guān)認(rèn)證活動(dòng)的要求.確保您在使用中安心,放心,用水無(wú)憂.