溶源性細(xì)菌的檢查與鑒定方法
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
溶源性細(xì)菌的檢查與鑒定
原理
細(xì)菌染色體上整合有前噬菌體(或稱原噬菌體)并能正常生長繁殖而不被裂解的細(xì)菌,稱為溶源性細(xì)菌.溶源性細(xì)菌在自然界中普遍存在,而且自發(fā)裂解,釋放溫和噬菌體,但頻率較低(10-2~105)物理方法(如紫外線和高溫)和化學(xué)方法(如絲裂霉素C)可誘導(dǎo)大部分溶源菌裂解并釋放溫和噬菌體.溶源性細(xì)菌對同一種或關(guān)系密切的噬菌體具有免疫性,因此對于溶源菌的檢查必須有相應(yīng)的敏感菌株才能確定,敏感菌株對以從待檢的溶源菌株相近的種或變種或不同菌株中找到.
溶源性細(xì)菌裂解釋放噬菌體,會給發(fā)酵工業(yè)帶來威脅,溶源性細(xì)菌使宿主細(xì)胞發(fā)生溶源轉(zhuǎn)變,不僅可以保護溶源菌免受同源噬菌體的再感染,還會賦予宿主細(xì)胞新的特性,溫和噬菌體已被廣泛用于轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因工程載體和分子生物學(xué)等領(lǐng)域.本實驗采用誘導(dǎo)方法使溶源細(xì)菌裂解.再用敏感菌雙層平板法檢測誘導(dǎo)后噬菌體釋放數(shù)目的增加,從而確認(rèn)細(xì)菌的溶源性.
材料
樣品待檢菌——大腸桿菌225(λ),敏感菌——大腸桿菌226.培養(yǎng)基及藥品和試劑LB固體、半固體和液體培養(yǎng)基,1%蛋白胨,100mmol/lTris-HCL(pH7.6)緩沖液或生理鹽水,氯仿,0.2%檸檬酸鈉溶液.設(shè)備水浴箱、臺式離心機、紫外光燈、搖床等.器皿及其他試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管,離心管、濾膜、濾膜濾菌器等.
方法與步驟
本實驗采用紫外線處理誘導(dǎo)溶源菌裂解,未經(jīng)誘導(dǎo)處理的溶源菌菌懸液做對照.
溶源菌培養(yǎng)將經(jīng)LB斜面活化的大腸桿菌225(λ),接種于裝有20毫升LB培養(yǎng)液的250毫升三角瓶內(nèi),30振蕩培養(yǎng)16h,再從中取2毫升菌懸液接入另裝有20毫升LB培養(yǎng)液的250毫升三角瓶內(nèi),37振蕩培養(yǎng)2h至對數(shù)期.
排除游離噬菌體如待檢菌株為芽孢桿菌,可先制成孢子懸液,再經(jīng)8010分鐘處理,殺死溶源菌表面可能吸附的及游離的噬菌體；如待檢菌抹為非芽孢桿菌,可利用噬菌體制備的抗血清或0.2%檸檬酸鈉溶液洗滌對數(shù)期溶源菌細(xì)胞,除去表面吸附的及游離的噬菌體.然后經(jīng)4000r/分鐘離心10分鐘,上清液可加人敏感指示菌做雙層平板測定,用于檢驗樣品屮足孖釕游離的噬菌體及吸附「溶源菌表曲的噬菌體,離心后的菌體細(xì)胞進行誘導(dǎo)處理.
誘導(dǎo)溶源菌離心后收集的菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次,用生理鹽水或100mmol/lTris-HCL緩沖液(pH7.0)制成終濃度為1011個/毫升細(xì)胞的菌懸液,每皿加5毫升菌懸液,經(jīng)紫外燈30瓦,距離30厘米、照射30s,立即加入5毫升雙倍濃度的LB培養(yǎng)液,混勻后37黑暗中培養(yǎng)2h.
溶源性菌株檢查按雙層瓊脂法操作,取上述誘導(dǎo)裂解液加入幾滴氯仿,以10倍稀釋法適當(dāng)稀釋,選擇后3個稀釋度的稀釋液,毎個稀釋液取0.3毫升與0.2毫升對數(shù)期敏感大腸桿菌226菌懸液混勻,再加入融化后冷卻至45的LB半體培養(yǎng)基,立即混勻,隨即傾入LB固體培養(yǎng)基平板上,待凝固后,37培養(yǎng)6h觀察.經(jīng)過培養(yǎng)的平板如果有大量噬菌斑出現(xiàn)就證明被檢菌株是溶源菌.