支原體檢查法
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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支原體檢查法
主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、病毒種子批、對照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查時(shí),應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法(DNA染色法).病毒類疫苗的病毒收獲液、原液采用培養(yǎng)法檢查支原體,必要時(shí),亦可采用指示細(xì)胞法篩選培養(yǎng)基.也可采用經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法
第一法培養(yǎng)法
推薦培養(yǎng)基及其處方
(1)支原體肉湯培養(yǎng)基
豬胃消化液500毫升,氯化鈉2.5克,牛肉浸液(1:2)500毫升,葡萄糖5.0克,酵母浸粉5.0克,酚紅0.02克,pH值7.6±0.2.于121滅菌15分鐘.
(2)精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基
豬胃消化液500毫升,牛肉浸液(1:2)500毫升,葡萄糖1.0克,酵母浸粉5.0克,L-精氨酸2.0克,酚紅0.02克,氯化鈉2.5克,pH值7.1±0.2.于121滅菌15分鐘.
(3)支原體半流體培養(yǎng)基按(1)項(xiàng)處方配制,培養(yǎng)基中不加酚紅,加入瓊脂2.5至3.0克.
(4)支原體瓊脂培養(yǎng)基按(1)項(xiàng)處方配制,培養(yǎng)基中不加酚紅,加入瓊脂13.0至15.0克.
培養(yǎng)基靈敏度檢查(變色單位試驗(yàn)法)(1)菌種肺炎支原體(ATCC15531)、口腔支原體(ATCC23714),由國家藥品檢定機(jī)構(gòu)分發(fā).
(2)操作將菌種接種于適宜的支原體培養(yǎng)基中,經(jīng)36±1培養(yǎng)至培養(yǎng)基變色,盲傳2代后,將培養(yǎng)物接種到待檢培養(yǎng)基中,做10倍系列稀釋,肺炎支原體稀釋至10-7至10-9,接種在支原體肉湯培養(yǎng)基內(nèi)；口腔支原體稀釋至10-3至10-5,接種在精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基內(nèi).每個(gè)稀釋度接種3支試管,置36士1培養(yǎng)7至14天,觀察培養(yǎng)基變色結(jié)果.
(3)結(jié)果判定以接種后培養(yǎng)基管數(shù)的2/3以上呈現(xiàn)變色的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度.
液體培養(yǎng)基的靈敏度：肺炎支原體(ATCC15531)應(yīng)達(dá)到10-8,口腔支原體(ATCC23714)應(yīng)達(dá)到10-4.
檢查法(1)供試品如在分裝后24小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行支原體檢查者可貯存于2至8；超過24小時(shí)應(yīng)置-20以下貯存.
(2)檢查支原體采用支原體半流體培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基(或支原體瓊脂培養(yǎng)基).支原體半流體培養(yǎng)基(或瓊脂培養(yǎng)基)在使用前應(yīng)煮沸10至15分鐘,冷卻至56左右,然后加人滅能新生牛血清(培養(yǎng)基與血清體積比為8:2),并可酌情加入適量青霉素,充分搖勻.液體培養(yǎng)基除無需煮沸外,使用前亦應(yīng)同樣補(bǔ)加上述成分.
取每支裝量為10毫升的支原體半流體培養(yǎng)墓(已冷至36士1)和支原體肉湯培養(yǎng)基各4支,每支培養(yǎng)基接種供試品0.5至1.0毫升,置36士1培養(yǎng)21天.于接種后的第7天從4支中取2支進(jìn)行次代培養(yǎng),每1支培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種支原體半流體培養(yǎng)基及支原體肉湯培養(yǎng)基各2支,置36士l培養(yǎng)21天,每隔3天觀察1次．
(3)結(jié)果判定培養(yǎng)結(jié)束時(shí),如接種供試品的培養(yǎng)基均無支原體生長,則供試品判為合格；如疑有支原體生長,可取加倍量供試品復(fù)試,如無支原體生長,供試品判為合格,如仍有支原體生長,則供試品判為不合格.
質(zhì)量檢定部門應(yīng)會同培養(yǎng)基制造部門定期抽檢支原體培養(yǎng)基靈敏度.
第二法指示細(xì)胞培養(yǎng)法(DNA染色法)
將供試品接種于指示細(xì)胞(無污染的Vero細(xì)胞或經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞)中培養(yǎng)后,用特異熒光染料染色.如供試品污染支原體,在熒光顯微鏡下可見附在細(xì)胞表面的支原體DNA著色.
試劑(1)二苯甲酰胺熒光染料濃縮液稱取二苯甲酰胺熒光染料5毫克,加人100毫升不含酚紅和碳酸氫鈉的Hank's平衡鹽溶液中,室溫下用磁力攪拌器攪拌30至40分鐘,使完全溶解,-20避光保存.
(2)二苯甲酰胺熒光染料工作液無酚紅和碳酸氫鈉的Hank's溶液100毫升中加人二苯甲酰胺熒光染料濃縮液l毫升,混勻.
(3)固定液醋酸:甲醉(體積比1:3)混合溶液.
(4)封片液量取0.1mol/L枸櫞酸溶液22.2毫升、0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液27.8毫升、甘油50.0毫升,混勻,調(diào)pH值至5.5.
培養(yǎng)墓及指示細(xì)胞(1)DMEM完全培養(yǎng)基.
(2)DMEM無抗生素培養(yǎng)基.
(3)指示細(xì)胞(已證明無支原體污染的Vero細(xì)胞或其他傳代細(xì)胞)取培養(yǎng)的Vero細(xì)胞經(jīng)消化后,制成每l毫升含105的細(xì)胞懸液,以每孔0.5毫升接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板或其他容器,每孔再加無抗生素培養(yǎng)基3毫升,于36士1、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜,備用.
供試品處理(1)細(xì)胞培養(yǎng)物將供試品經(jīng)無抗生素培養(yǎng)液至少傳1代,然后取細(xì)胞已長滿的且3天未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢.
(2)毒種懸液如該毒種對指示細(xì)胞可形成病變并影響結(jié)果判定時(shí),應(yīng)用對支原體無抑制作用的特異抗血清中和病毒后或用不產(chǎn)生細(xì)胞病變的另一種指示細(xì)胞進(jìn)行檢查.
(3)其他供試品檢查時(shí)所選用的指示細(xì)胞應(yīng)為該供試品對其生長無影響的細(xì)胞.
測定法于制備好的指示細(xì)胞培養(yǎng)板中加入供試品(細(xì)胞培養(yǎng)上清液)2毫升(毒種或其他供試品至少l毫升),于36士1、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)3至5天.指示細(xì)胞培養(yǎng)物至少傳代1次,末次傳代培養(yǎng)用含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)3至5天后,吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液,加人固定液5毫升,放置5分鐘,吸出固定液,再加5毫升固定液固定10分鐘,吸出固定液,使蓋玻片在空氣中干操,加二苯甲酰胺熒光染料(或其他DNA染料)工作液5毫升,加蓋,室溫放置30分鐘,吸出染液,每孔用水5毫升洗3次,吸出水,蓋玻片于空氣中干燥,取潔凈載玻片加封片液1滴,分別將蓋玻片面向下蓋在封片液上制成封片.用熒光顯微鏡觀察.
用無抗生素培養(yǎng)基2毫升替代供試品,同法操作,作為陰性對照．
用已知陽性的供試品標(biāo)準(zhǔn)菌株2毫升替代供試品,同法操作,作為陽性對照.
結(jié)果判定(1)陰性對照僅見指示細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光.
(2)陽性對照熒光顯微鏡下除細(xì)胞外,可見大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆粒.
當(dāng)陰性及陽性對照結(jié)果均成立時(shí),試驗(yàn)有效.
如供試品為陰性,則供試品判為合格；如供試品為陽性或可疑時(shí),應(yīng)進(jìn)行重試；如供試品仍為陽性時(shí),供試品判為不合格.