霍亂菌體原液制造及檢定要求
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家電話生產(chǎn)企業(yè)
霍亂菌體原液制造及檢定要求
本品系用01群古典生物型或Eltor生物型霍亂弧菌經(jīng)培養(yǎng)、加人甲醛溶液殺菌后凍干制成,用于制備重組B亞單位/菌體霍亂疫苗(腸溶膠囊).
制造
菌種
生產(chǎn)用菌種應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定.
名稱及來源
采用霍亂弧菌01群古典生物型16012菌株或Eltor生物型18001菌株.來源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心.
種子批的建立
應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定.
種子批的傳代
主種子批菌種啟開后傳代次數(shù)不得超過5代;工作種子批菌種啟開后至接種生產(chǎn)用培養(yǎng)基傳代次數(shù)不得超過5代.
培養(yǎng)特性及染色鏡檢
將待檢菌種接種于pH7.8至8.2的肉湯瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基,置37攝氏度培養(yǎng)18至24小時(shí),應(yīng)為光滑、半透明的圓形菌落.涂片染色鏡檢應(yīng)為革蘭氏陰性短小弧形桿菌.
生化反應(yīng)
發(fā)酵甘露糖和蔗糖,產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣;不發(fā)酵阿拉伯糖.
血清學(xué)試驗(yàn)
(1)用特異性血清做玻片凝集試驗(yàn)時(shí),應(yīng)與本型血清相凝集.
(2)用霍亂弧菌0多價(jià)診斷血清(原效價(jià)不低于1:640)與18至24小時(shí)的01霍亂弧菌培養(yǎng)物以生理氯化鈉溶液稀釋成細(xì)菌懸液(每1毫升含菌1.8X 109左右)進(jìn)行定量凝集試驗(yàn),凝集效價(jià)應(yīng)不低于原血清效價(jià)之半.
生產(chǎn)用種子
啟開工作種子批菌種,接種于LB培養(yǎng)基上,制備生產(chǎn)用工作種子.
生產(chǎn)用培養(yǎng)基
采用改良M9培養(yǎng)基.生產(chǎn)用培養(yǎng)基不得含有使人產(chǎn)生毒性反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì).
培養(yǎng)收獲
以液體培養(yǎng)法培養(yǎng)的種子液,用無菌操作注人培養(yǎng)罐內(nèi),37攝氏度培養(yǎng),種子罐4至8小時(shí),發(fā)酵罐6至10小時(shí).
純菌檢查
培養(yǎng)物涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,應(yīng)為革蘭氏陰性短小弧形桿菌,若鏡檢發(fā)現(xiàn)有雜菌生長(zhǎng),應(yīng)廢棄.
殺菌
加人終濃度不超過1% (毫升/毫升) 的甲醛溶液,于37攝氏度殺菌2至3天.
殺菌檢查
純菌檢查合格的菌液,應(yīng)取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、瓊脂斜面及堿性瓊脂斜面各1管,于37攝氏度培養(yǎng)5天,若有菌生長(zhǎng)應(yīng)廢棄.
收獲
用0.45um膜進(jìn)行截向流超濾濃縮獲取菌體,超濾后用滅菌生理氯化鈉溶液連續(xù)洗滌,并制成菌懸液分裝于容器中.
原液檢定
染色鏡檢
應(yīng)為典型革蘭氏陰性短小弧形桿菌.
凝集試驗(yàn)
與霍亂弧菌O多價(jià)診斷血清做玻片定性凝集試驗(yàn),呈陽性反應(yīng).
無菌檢查
依法檢查(通則1101),應(yīng)符合規(guī)定.另加試1%堿性蛋白胨水培養(yǎng)基1管,于30至35攝氏度培養(yǎng),應(yīng)無菌生長(zhǎng).
濃度測(cè)定、按“中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)”測(cè)定,每1毫升含菌應(yīng)為5.0X101至1.05X1012.
游離甲醛殘 留量每5.0X1010菌中含游離甲醛不得過0. 16mg (通則3207第- -法).
霍亂毒素殘留 量
采用間接ELISA法檢測(cè)霍亂毒素(攝氏度T)殘留量,每5.0X1010菌中含霍亂毒素不得過10ng.以神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)包被,用適宜稀釋液將霍亂毒素對(duì)照品和供試品稀釋至適宜濃度測(cè)定.以對(duì)照品溶液吸光度對(duì)其相應(yīng)的濃度進(jìn)行四參數(shù)方程擬合,將供試品吸光度值代人四參數(shù)方程擬合,得到供試品中攝氏度T含量.
保存及有效期
于2-8攝氏度保存,自收菌之日起保存時(shí)間不超過6個(gè)月.