亞硫酸鹽還原菌及檢測實(shí)驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
亞硫酸鹽還原菌及檢測實(shí)驗(yàn)
一、生物學(xué)特性與衛(wèi)生學(xué)意義
亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的一群細(xì)菌,而不是一個生物學(xué)分類單位.多指厭氧芽胞桿菌,代表性菌株是致黑梭狀芽胞桿菌,其他常見的還有產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌等.此類細(xì)菌的主要特征是將亞硫酸鹽還原為硫化物,多為有動力的革蘭氏陽性菌,可形成芽胞,厭氧生長.
厭氧亞硫酸鹽還原菌的孢子在自然環(huán)境中廣泛存在,通常出現(xiàn)在人和動物的糞便排泄物,廢水和土壤中.與大腸桿菌和其它桿菌不同的是,由于它們的孢子比營養(yǎng)體對物理和化學(xué)因子具有更強(qiáng)的抵抗力,所以可以在自然環(huán)境中存活很大時(shí)間.因而,通常將他們作為長期污染或間斷污染的指示菌.它們甚至可以抵抗正常水處理所用氯的工作濃度,因此,它們對判斷是否已達(dá)到控制目的非常有用.由于此類細(xì)菌抵抗力強(qiáng),即使在經(jīng)適當(dāng)加工處理的加工食品中其芽胞仍會存活,條件適宜時(shí)又會生長繁殖,造成食品品質(zhì)降低或腐敗,甚至?xí)鹗澄镏卸镜奈ｋU(xiǎn).因此在食品的制備、貯存以及食品加工廠環(huán)境衛(wèi)生控制上頗受重視,作為食品、礦泉水、加工設(shè)備衛(wèi)生、生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況的評估指標(biāo),正確得到越來越廣泛的應(yīng)用.
該類細(xì)菌的檢測多用于環(huán)境水質(zhì)和生活飲用水污染狀況的評估,在九十年代中后期開始在食品衛(wèi)生領(lǐng)域中有所要求,但多局限于歐洲國家和地區(qū),如法國、瑞士、英國、捷克等歐盟成員國.到目前為止,該菌一般不被作為食品衛(wèi)生常規(guī)檢測項(xiàng)目和致病菌檢測內(nèi)容,我國和美國未將該檢測項(xiàng)目列入食品微生物檢測項(xiàng)目和要求中.
二、檢測方法
由于此類細(xì)菌以形成芽胞、厭氧生長和還原亞硫酸鹽為硫化氫為主要特征,往往無需作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,因此在檢測中將滿足以上三個條件的一群細(xì)菌全部認(rèn)定為厭氧亞硫酸鹽還原菌.
檢測方法一般包括以下三部分:檢樣在接種前在80-100水浴中處理10-15分鐘,以殺滅抵抗力弱的芽胞細(xì)菌的營養(yǎng)體,同時(shí)刺激芽胞的繁殖;通過選擇性培養(yǎng)如亞硫酸鐵鹽瓊脂等判定是否具有還原亞硫酸鹽的能力,如果有則進(jìn)一步與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽如枸櫞酸鐵反應(yīng),使菌落呈現(xiàn)黑色;培養(yǎng)基接種后置于厭氧環(huán)境中培養(yǎng)確認(rèn)厭氧特征.也可在培養(yǎng)基中加入抗生素等抑制劑抑制其它非亞硫酸鹽還原菌的生長.
下面詳細(xì)介紹亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗(yàn)方法.
培養(yǎng)基和試劑,氯化鈉胰蛋白胨稀釋液,亞硫酸鐵瓊脂,過氧化氫試劑
儀器和設(shè)備
均質(zhì)器:用于處理固體樣品
培養(yǎng)罐(箱),帶產(chǎn)生厭氧環(huán)境的設(shè)備或試劑
恒溫培養(yǎng)箱:37±1或46±1
振蕩器
吸管:1毫升、10毫升,具0.1毫升刻度
培養(yǎng)皿:直徑為90mm
稀釋瓶:容量為500毫升和250毫升的廣口瓶
天平:感量0.1g
抽樣和試樣制備
抽樣:參照SN0330-94規(guī)定抽樣
試樣制備:無菌操作稱取剪碎后的樣品25g,置于裝有225毫升氯化鈉胰蛋白胨稀釋液的廣口瓶中.若檢測亞硫酸鹽還原梭菌的芽胞,可7520分鐘或煮沸保持10分鐘熱處理樣品,之后以流水迅速冷卻至室溫后再稱取.充分混勻后據(jù)樣品污染情況做進(jìn)一步的系列十倍梯度稀釋.
檢驗(yàn)步驟與計(jì)數(shù)
菌落計(jì)數(shù)法:適用于檢查未經(jīng)加工處理的生鮮食品及亞硫酸鹽還原梭菌計(jì)數(shù)>10g(毫升)的食品.
接種和培養(yǎng)
對每一份試樣,選用適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣液,分別用滅菌吸管吸取1毫升,一式雙份地接種于每個滅菌的培養(yǎng)皿中.
傾注約15毫升制備好的并于水浴箱保溫至45的亞硫酸鐵瓊脂.從制備最初稀釋液結(jié)束到傾注培養(yǎng)基于最后一個平皿所用的時(shí)間不應(yīng)超過15分鐘.仔細(xì)將接種物和培養(yǎng)基充分混勻,水平放置,使其凝固.待混合物凝固后,在傾注10毫升同樣的培養(yǎng)基于已凝固的培養(yǎng)基上作為隔層以防氧吸附,并防止細(xì)菌蔓延生長.待該隔層凝固后反轉(zhuǎn)制備好的平板,于37±1厭氧培養(yǎng)24-48h.若對培養(yǎng)溫度有特殊要求(如46),可依據(jù)情況進(jìn)行培養(yǎng).
計(jì)數(shù)
亞硫酸鹽還原梭菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈暗灰色或黑色菌落.37±1厭氧培養(yǎng)24h后,計(jì)數(shù)典型的菌落;若平板上無特征性菌落或菌落較小(<0.5mm),則需繼續(xù)培養(yǎng)24h再計(jì)數(shù);若48h后的菌落增大以至相連,則以24h的計(jì)數(shù)為準(zhǔn),反之則以48h為準(zhǔn).
那些僅產(chǎn)生氫(而不是H2S)的厭氧菌生長時(shí)也可還原亞硫酸鹽而導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)彌散的、非典型的普遍變黑,這種現(xiàn)象不應(yīng)計(jì)數(shù).
取特征性菌落(不少于5個)移種于皰肉培養(yǎng)基中,37±1厭氧培養(yǎng)24-72h.待出現(xiàn)生長特征(培養(yǎng)液渾濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味)后,按5條進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn).對陽性結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù).
讀取帶有10-100個黑色菌落的平皿,結(jié)果以相應(yīng)稀釋度的兩個平板的菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)來計(jì)算每克樣品中亞硫酸鹽還原梭菌數(shù).結(jié)果報(bào)告如下:估計(jì)亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(毫升).
若相應(yīng)測試試樣的兩個平板上均無特征性菌落,以<10/g(毫升)報(bào)告
最近似值(MPN)法:適用于檢查亞硫酸鹽還原梭菌計(jì)數(shù)≤10g(毫升)及含有受損傷的亞硫酸鹽還原梭菌的加工食品.
接種和培養(yǎng)
增菌
選用適宜的三個連續(xù)稀釋的樣液,從每個樣液中分別吸取1毫升,一式三份地接種于3管裝有皰肉培養(yǎng)基的試管中,接種后上面覆蓋一層無菌的液體石蠟,37±1培養(yǎng)24-72h.待出現(xiàn)生長特征(培養(yǎng)液混濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味)后,按5.1條進(jìn)行鏡檢.反之,則報(bào)告陰性.
分離培養(yǎng)
取增菌培養(yǎng)物1毫升置于滅菌的培養(yǎng)皿中,傾注約15毫升45的亞硫酸鐵瓊脂.仔細(xì)將接種物和培養(yǎng)基充分混勻,待其凝固后,再傾注10毫升同樣的培養(yǎng)基作為隔層,于37±1厭氧培養(yǎng)24-48h.生成的暗灰色或黑色菌落,按5條加以證實(shí);反之,則報(bào)告陰性.
結(jié)果計(jì)算
計(jì)數(shù)每個稀釋度得到的陽性反應(yīng)管數(shù).利用MPN表,由陽性管數(shù)估算每克(毫升)試樣中亞硫酸鹽還原梭菌最近似值.結(jié)果報(bào)告如下:估計(jì)亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(毫升).
證實(shí)試驗(yàn)
形態(tài)觀察:取皰肉培養(yǎng)物涂片,鏡檢,作革蘭氏染色,檢查培養(yǎng)物細(xì)菌形態(tài).亞硫酸鹽還原梭菌為革蘭氏陽性桿菌,單個散在,成對、成小鏈狀或并列地聚堆存在.產(chǎn)芽胞時(shí),芽胞呈卵圓形或球形,位于中央、次終端或終端.
過氧化氫酶試驗(yàn)
在潔凈載玻片上滴1滴培養(yǎng)物,再滴加1-2滴3%的過氧化氫.出現(xiàn)小氣泡說明有過氧化氫酶活性.亞硫酸鹽還原梭菌不形成過氧化氫酶.