鞭毛染色法及活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的觀察
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
鞭毛染色法及活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的觀察
一,目的要求
學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌鞭毛染色的基本方法及觀察細(xì)菌鞭毛的著生情況.學(xué)習(xí)用壓滴法和懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性.
二,基本原理
鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)“器官”,一般細(xì)菌的鞭毛都非常纖細(xì),其直徑為0.01至0.02μm,在普通光學(xué)顯微鏡的分辨力限度以外,故需要用特殊的鞭毛染色法,才能看到.鞭毛染色是借媒染劑和染色劑的沉淀作用,使染料堆積在鞭毛上,以加粗鞭毛的直徑,同時(shí)使鞭毛著色,在普通光學(xué)顯微鏡下能夠看到.在顯微鏡下觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性,也可以初步判斷細(xì)菌是否有鞭毛.通常使用壓滴法或懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性.觀察時(shí),要適當(dāng)減弱光線,增加反差,如果光線很強(qiáng),細(xì)菌和周圍的液體就難以辨別.
三,器材
蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis),假單胞菌(Pseudomonassp.),金黃色葡萄球菌；鞭毛染色液,萬分之一的美藍(lán)水溶液,凡士林,無菌水,載玻片,凹玻片,蓋玻片等.
四,操作步驟
1.鞭毛染色
方法一
(1)菌種用新培養(yǎng)的菌種為宜,如所用菌種已長(zhǎng)期未移種,則用新制備的斜面連續(xù)移種2至3次后再使用.最好是將經(jīng)活化的菌種接種到新制備的瓊脂斜面或半固體培養(yǎng)基平皿上,培養(yǎng)10小時(shí)左右,備用.鞭毛染色可以直接從平板上挑選菌落,或從斜面上刮菌苔涂片即可,但必須注意動(dòng)作盡量輕,以免鞭毛從菌體上脫落.菌落應(yīng)是生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)較好的瓊脂平板(如血平板,營(yíng)養(yǎng)瓊脂)上的過夜培養(yǎng)物.不可采用有抑制劑的選擇性培養(yǎng)基,如中國(guó)藍(lán),麥康凱,SS瓊脂等.觀察鞭毛時(shí),應(yīng)耐心尋找整個(gè)涂片上的菌細(xì)胞,因?yàn)椴⒉皇峭科厦總€(gè)細(xì)菌細(xì)胞上的鞭毛特性及數(shù)量都一樣,應(yīng)以鞭毛數(shù)量最多的菌細(xì)胞為準(zhǔn).
(2)制片在載玻片的一端滴一滴蒸餾水,用接種環(huán)挑取少許備用的菌苔,最好從菌落的邊緣取菌苔,注意不要挑上培養(yǎng)基,在載玻片的水滴中輕沾幾下.將載玻片稍傾斜,使菌液隨水滴緩慢流到另一端,然后平放在空氣中干燥.
(3)染色涂片干燥后滴加A液染3至5分鐘,用蒸餾水沖洗,或?qū)埶疄r干或用B液沖去殘水(注意:一定要充分洗凈A液后再加B液,否則背景很臟).洗凈A液滴加B液后,將玻片在酒精燈上稍加熱,使其微冒蒸汽且不干,一般染30至60秒鐘.然后用蒸餾水沖洗,自然干燥.
(4)鏡檢鏡檢時(shí),如未見鞭毛,應(yīng)在整個(gè)涂片上多找?guī)讉€(gè)視野,有時(shí)只在部分涂片上染出鞭毛.菌體為深褐色,鞭毛為褐色.
細(xì)菌鞭毛染色要求非常小心細(xì)致,染色成功的關(guān)鍵主要決定于:(a)菌種活化的情況,即要連續(xù)移種幾次；(b)菌齡要合適,一般在幼齡時(shí)鞭毛情況最好,易于染色；(c)新鮮的染色液；(d)載玻片要求干凈無油污.鞭毛染色所用載玻片的清洗方法如下:
選擇光滑無傷痕的玻片.先用洗衣粉煮沸,洗衣粉最好在洗玻片前加蒸餾水煮沸,用濾紙過濾去渣.為了避免玻片彼此磨損,最好把載玻片放在特制的架上煮,煮畢稍冷卻后取出,用清水洗凈,再放入濃洗液中浸泡24小時(shí)左右,取出用清水沖洗殘酸,最后用蒸餾水洗凈,瀝干水并放于95％乙醇中脫水,取出玻片,用火焰燒去酒精,立即使用.如不立刻使用,可存放于干凈的盒中或50％乙醇中短期存放.由于空氣中常常漂浮油污,最好立即使用.在洗凈的玻片上滴上水滴后應(yīng)能均勻散開.
方法二鞭毛染色(改良Ryu法)
1.玻片的處理:要求用新的載玻片.用前須在95％酒精中浸泡24小時(shí)以上.用時(shí)從酒精中取出,以干凈紗布擦干后使用.
2.在玻片上滴蒸餾水兩滴.一張玻片上可同時(shí)制2個(gè)涂片.
3.用接種環(huán)挑取血平板上菌落少許,將細(xì)菌點(diǎn)在玻片上的蒸餾水滴的頂部.一般只需點(diǎn)一下,僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴,不可攪動(dòng),以免鞭毛脫落.
4.玻片置室溫自然干燥.
5.滴加染液于玻片上,染色.
6.約10～15min后,用蒸餾水緩慢沖去染液.沖洗時(shí)應(yīng)避免使染液表面的金屬光澤液膜滯留在玻片上,影響鏡檢.
7.玻片自然干燥后,鏡檢時(shí)應(yīng)從涂片的邊緣開始,逐漸移向中心.尋找細(xì)菌較少的視野,鞭毛容易觀察.細(xì)菌密集的地方,鞭毛被菌體擋住,不易觀察.
2.運(yùn)動(dòng)性觀察
(1)壓滴法
(a)分別將5毫升無菌水倒入蘇云金芽孢桿菌,假單胞菌和金黃色葡萄球菌的斜面培養(yǎng)物內(nèi),制成菌懸液.各取出1毫升菌液稀釋至肉眼看不到混濁為止.
(b)各取2至3環(huán)三種稀釋菌液,分別放在三片清潔的載玻片中央,再各放一環(huán)萬分之一的美藍(lán)水溶液混勻.
(c)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片,使其一邊先接觸菌液,然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下,注意不要產(chǎn)生氣泡.按此法分別將蓋玻片覆蓋于三種菌液上.
(d)先以低倍鏡找到標(biāo)本,再用高倍鏡觀察,觀察時(shí)光線要調(diào)得暗些.
(2)懸滴法
(a)在潔凈蓋玻片周圍涂少許凡士林.
(b)在蓋玻片中央滴一小滴菌液,或用接種環(huán)取1至2環(huán)菌液置于中央.
(c)將凹玻片反轉(zhuǎn),使凹窩中心對(duì)準(zhǔn)蓋玻片上的菌液滴,液滴不得與凹玻片接觸,以接種環(huán)柄輕壓使蓋玻片與凹玻片粘在一起,液滴處于封閉的小室中,防止液滴干燥和氣流的影響.
(d)小心將凹玻片翻轉(zhuǎn)過來,使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩中心.
(e)先用低倍鏡找到懸滴邊緣,再用高倍鏡觀察.觀察時(shí)光線要調(diào)得暗一些.
用懸滴法分別觀察蘇云金芽孢桿菌,假單胞菌和金黃色葡萄球菌的運(yùn)動(dòng)性.細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)有一定的前進(jìn)方向,并可轉(zhuǎn)彎,極生單鞭毛菌類多為直線運(yùn)動(dòng),周生鞭毛菌類多作波浪式運(yùn)動(dòng).
五,實(shí)驗(yàn)報(bào)告
結(jié)果：你觀察到的三種菌是否都有鞭毛?繪圖表示你所觀察到的細(xì)菌鞭毛著生情況.
思考題
(1)你所觀察到的三種菌是否都具運(yùn)動(dòng)性?為什么?(2)沒有鞭毛的活細(xì)菌在光學(xué)顯微鏡下完全不動(dòng)嗎?真實(shí)地記錄你觀察到的現(xiàn)象,并進(jìn)行解釋.
鞭毛染色液(方法一)
A液:單寧酸5克
FeCl31.5克
蒸餾水100毫升
福爾馬林(15%)2.0毫升
NaOH(1%)1.0毫升
配好后,當(dāng)日使用,次日效果差,第三日則不宜使用.
B液:AgNO32克
蒸餾水100毫升
待AgNO3溶解后,取出10毫升備用,向其余的90毫升AgNO3中滴入濃NH4ON,使之成為很濃厚的懸浮液,再繼續(xù)滴加NH4OH,直到新形成的沉淀又重新剛剛?cè)芙鉃橹?再將備用的10毫升AgNO3慢慢滴入,則出現(xiàn)薄霧,但輕輕搖動(dòng)后,薄霧狀沉淀又消失,再滴入AgNO3,直到搖動(dòng)后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止.如所呈霧不重,此染劑可使用一周,如霧重,則銀鹽沉淀出,不宜使用.
鞭毛染色液(方法二)
A液:5％石炭酸10毫升
鞣酸2克
飽和硫酸鋁鉀液10毫升
B液:結(jié)晶紫酒精飽和液
應(yīng)用液:A液10份,B液1份,混合,室溫存放.