細(xì)菌的鞭毛染色方法步驟和應(yīng)用事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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細(xì)菌的鞭毛染色方法
細(xì)菌的鞭毛極細(xì),直徑一般為10—20nm,只有用電子顯微鏡才能觀察到.但是,如采用特殊的染色法,則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它.鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先用媒染劑處理,讓它沉積在鞭毛上,使鞭毛直徑加粗,然后再進(jìn)行染色.常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成.現(xiàn)推薦以下兩種染色法.
一、實(shí)驗(yàn)器材
1.活材料:培養(yǎng)12-16h的水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae),粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratia marcescens)或假單細(xì)胞菌(Pseudomonas sp.)斜面菌種.2.染色液和試劑:硝酸銀染色液Leifson染色液、香柏油、二甲苯.3.器材:載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號(hào)筆、玻片擱架、鑷子、接種環(huán),顯微鏡.
二、實(shí)驗(yàn)方法
1.鍍銀法染色
(1)清洗玻片 選擇光滑無(wú)裂痕的玻片,最好選用新的.為了避免玻片相互重疊,應(yīng)將玻片插在專(zhuān)用金屬架上,然后將玻片置洗衣粉過(guò)濾液中(洗衣粉煮沸后用濾紙過(guò)濾,以除去粗顆粒),煮沸20分鐘.取出稍冷后用自來(lái)水沖洗、晾干,再放入濃洗液中浸泡5—6天,使用前取出玻片,用自來(lái)水沖去殘酸,再用蒸餾水洗.將水瀝干后,放入95%乙醇中脫水.(2)菌液的制備及制片:菌齡較老的細(xì)菌容易失落鞭毛,所以在染色前應(yīng)將待染細(xì)菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上(培養(yǎng)基表面濕潤(rùn),斜面基部含有冷凝水)連續(xù)移接3-5代,以增強(qiáng)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)力.最后一代菌種放恒溫箱中培養(yǎng)12—16h.然后,用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數(shù)環(huán),移至盛有1—2mL無(wú)菌水的試管中,使菌液呈輕度混濁.將該試管放在37恒溫箱中靜置10分鐘(放置時(shí)間不宜太長(zhǎng),否則鞭毛會(huì)脫落),讓幼齡菌的鞭毛松展開(kāi).然后,吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端,立即將玻片傾斜,使菌液緩慢地流向另一端,用吸水紙吸去多余的菌液.涂片放空氣中自然干燥.用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng).方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養(yǎng)基熔化后倒入無(wú)菌平皿中,待凝固后在平板
中央點(diǎn)接活化了3-4代的細(xì)菌,恒溫培養(yǎng)12-16h后,取擴(kuò)散菌落的邊緣制作涂片.(3)染色
中央點(diǎn)接活化了3-4代的細(xì)菌,恒溫培養(yǎng)12-16h后,取擴(kuò)散菌落的邊緣制作涂片.(3)染色滴加A液,染4—6分鐘.用蒸餾水充分洗凈A液.用B液沖去殘水,再加B液于玻片上,在酒精燈火焰上加熱至冒氣,約維持0.5—1分鐘(加熱時(shí)應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染料,不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū)).用蒸餾水洗,自然干燥.
(4)鏡檢:先低倍,再高倍,最后用油鏡檢查.結(jié)果:菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色.
2.改良Leifson染色法
(1)清洗玻片法同1.(2)配制染料 見(jiàn)附錄二(一)9.染料配好后要過(guò)濾15-20次后染色效果才好.(3)菌液的制備及涂片菌液的制備同1.用記號(hào)筆在潔凈的玻片上劃分3—4個(gè)相等的區(qū)域.放1滴菌液于第一個(gè)小區(qū)的一端,將玻片傾斜,讓菌液流向另一端,并用濾紙吸去多余的菌液.干燥 在空氣中自然干燥.
(4)染色
加染色液于第一區(qū),使染料覆蓋涂片.隔數(shù)分鐘后再將染料加入第二區(qū),依此類(lèi)推(相隔時(shí)間可自行決定),其目的是確定最合適的染色時(shí)間,而且節(jié)約材料.水洗:在沒(méi)有傾去染料的情況下,就用蒸餾水輕輕地沖去染料,否則會(huì)增加背景的沉淀.干燥:自然干燥.
(5)鏡檢 先低倍觀察,再高倍觀察,最后再用油鏡觀察,觀察時(shí)要多找一些視野,不要企圖在1-2個(gè)視野中就能看到細(xì)菌的鞭毛.結(jié)果:菌體和鞭毛均染成紅色.
三、注意事項(xiàng)
1.鍍銀法染色比較容易掌握,但染色液必須每次現(xiàn)配現(xiàn)用,不能存放,比較麻煩.2.Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響,且染色液須經(jīng)15-20次過(guò)濾,要掌握好染色條件必須經(jīng)過(guò)一些摸索.3.細(xì)菌鞭毛極細(xì),很易脫落,在整個(gè)操作過(guò)程中,必須仔細(xì)小心,以防鞭毛脫落.4.染色用玻片干凈無(wú)油污是鞭毛染色成功的先決條件.