微生物檢測(cè)培養(yǎng)基的制備技術(shù)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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微生物檢測(cè)培養(yǎng)基的制備技術(shù)
一、稱取用精確度1/100的電子天平稱取培養(yǎng)基所需藥品.先根據(jù)配方計(jì)算出配制一定量培養(yǎng)基所需各種成分藥品的量,然后用天平準(zhǔn)確稱取.稱量時(shí)用稱量紙折疊成簸箕狀盛放藥品.
二、溶化
培養(yǎng)基放入燒杯或搪瓷缸中,慢慢加入少量所需水,邊加入邊用玻棒攪拌.如果培養(yǎng)基中不含有瓊脂,培養(yǎng)基不需要加熱;如果含有瓊脂,則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸,完全溶解后,再補(bǔ)齊所需水,并攪拌均勻(如圖3所示).如果配制的培養(yǎng)基量很大,可用不銹鋼鍋加熱溶化,可先用溫水加熱并隨時(shí)攪動(dòng),防止焦化,如有焦化現(xiàn)象,配制的培養(yǎng)基就不能使用,要重新配制.
配制培養(yǎng)基時(shí)不可用銅或鐵的容器溶化,因銅或鐵制容器可能會(huì)使培養(yǎng)基中的銅和鐵的含量超標(biāo),影響實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)基中銅含量大于0.3毫克/升,細(xì)菌不宜生長(zhǎng),鐵含量超過0.14毫克/升,妨礙細(xì)菌產(chǎn)毒素).對(duì)容易發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生沉淀的藥品,要分開溶解,最后加入培養(yǎng)基,如磷酸氫二鉀和硫酸鎂.
三、調(diào)pH
雖然培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)成分,能使培養(yǎng)基的pH盡可能的保持在要求的范圍內(nèi),但是配出的培養(yǎng)基若不符合要求,就要進(jìn)行必要的調(diào)整.如果有已校準(zhǔn)pH計(jì),可用pH計(jì),如果沒有,可用精密的pH試紙,再根據(jù)需要用1mo升/升氫氧化鈉或1mo升/升鹽酸(微調(diào)可用0.1氫氧化鈉或0.1mo升/升鹽酸)調(diào)制所需的pH.培基的pH一般為7.4～7.6,也有酸性或堿性的.用氫氧化鈉調(diào)整的需要高壓滅菌的培養(yǎng)基,在調(diào)整pH時(shí)要調(diào)至高出所需0.1個(gè)～0.2個(gè)單位,因用氫氧化鈉調(diào)整時(shí),高壓滅菌后,培養(yǎng)基的pH要降低0.1至0.2.如培養(yǎng)基中含有碳酸鈣成分,可不pH.
四、過濾
配成的培養(yǎng)基,若無特殊要求,可省略此步.若有沉淀或渾濁．需要澄清的．液體培養(yǎng)基可用油紙過濾.而固體培養(yǎng)基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過濾.如果過濾法還不能達(dá)到澄清的要求,則可用蛋清澄清法,即培養(yǎng)基加熱冷卻到50至60,裝入三角瓶?jī)?nèi)(不超過容量的二分之一),按1000毫升加人1個(gè)～2個(gè)雞蛋的蛋清,用力搖晃3-5分鐘,高壓蒸汽滅菌121、20分鐘,取出趁熱過濾即可.
五、分裝
配制好的培養(yǎng)基根據(jù)不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中,分裝試管,如果試管量很大,可用自動(dòng)分液器,如果試管量少,可用漏斗分裝.分裝量不超過容器容積的三分之二.三角瓶以不超過容積的二分之一為宜;瓊脂斜面以不超過試管長(zhǎng)度的五分之一為宜,滅菌后,擺成的斜面為培養(yǎng)基量的三分之一,底層為三分之二的量為宜;半固體瓊脂分裝量為試管長(zhǎng)度的三分之一;用來接種或保菌的高層瓊脂,分裝量為試管長(zhǎng)度的四分之一或三分之一,用來接種厭氧菌的要達(dá)到三分之二;瓊脂平板,內(nèi)徑為90mm的以13毫升至15毫升為宜,內(nèi)徑70mm的平板為8毫升至10毫升,制成的瓊脂平板若表面水分較多,可將平板倒扣,放置在37培養(yǎng)箱內(nèi)30分鐘,干燥后再用.每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝一小玻璃瓶(約20毫升)與該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌,為測(cè)定該批培養(yǎng)基最終pH.
六、滅菌
分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)立即進(jìn)行滅菌.滅菌的方法種類如下：
1.高壓蒸汽滅菌法
大多耐熱培養(yǎng)基都可用此法,小量分裝時(shí),用121,15分鐘;滅菌量大時(shí),用121,30分鐘滅菌;含糖類的培養(yǎng)基只能113至115,15分鐘滅菌,避免糖類遭破壞.
2.煮沸滅菌法
對(duì)含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基,可使用此方法.
3.過濾除菌
以過濾的方法除菌,用無菌操作技術(shù),定量加入培養(yǎng)基.血液、抗生素可用無菌操作技術(shù)抽取,加入冷卻到50左右的培養(yǎng)基中.培養(yǎng)基含有不耐熱的物質(zhì)時(shí),可用此法.
對(duì)升ST培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí),有時(shí)發(fā)酵管內(nèi)會(huì)有氣泡.為防止發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)生氣泡,可以采取以下幾項(xiàng)措施：
1.小倒管浸滿培養(yǎng)基(不留氣泡)后再加入到盛升ST的試管中.
2.滅菌鍋關(guān)閉放氣閥前,將鍋內(nèi)氣體排干凈.
3.試管塞不要塞得太緊(使用硅膠塞的時(shí)候),勿使用橡皮塞.
4.不要過早打開滅菌鍋,要等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時(shí)再打開滅菌鍋.
如果以上情況都做到還有氣泡,可用水做培養(yǎng)基組的對(duì)照試驗(yàn),若培養(yǎng)基組有氣泡,而對(duì)照組沒有氣泡可確定是培養(yǎng)基自身的原因.
七、倒平板
滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻到50后,倒入無菌干燥的培養(yǎng)皿中.培養(yǎng)基的溫度不能過高,否則容易在培養(yǎng)皿的內(nèi)蓋上形成太多的冷凝水;溫度太低,培養(yǎng)基又容易凝固成塊,無法制成平板.倒平板時(shí),應(yīng)在靠近酒精燈火焰進(jìn)行,以免外界的雜菌落入平板內(nèi),左手拿培養(yǎng)皿,右手拿三角瓶的底部,用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下,灼燒瓶口,用大拇指和食指把培養(yǎng)皿蓋打開一條縫,至瓶口剛好伸入,倒入培養(yǎng)基,以鋪滿底為限,不超過培養(yǎng)皿高度的三分之一,迅速蓋好蓋,放在桌面上,輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿,使培養(yǎng)基分布均勻,冷凝后即可.
八、擺斜面
裝在試管中的瓊脂培養(yǎng)基,在滅菌完成后,趁熱立即擺放在木棒(或玻璃棒)上,并成適當(dāng)?shù)男倍?冷卻后,瓊脂凝固即成斜面.斜面長(zhǎng)度不用超過試管二分之一.
九、質(zhì)量檢查培養(yǎng)基滅菌后仔細(xì)檢查一遍,發(fā)現(xiàn)有破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染,都要丟棄,不能再用.并測(cè)定其最終pH.還需進(jìn)行無菌檢查和效果檢查.無菌檢查是將滅菌后的培養(yǎng)基取1管(瓶)至2管(瓶),37恒溫培養(yǎng)1d～2d,確定無雜菌生長(zhǎng);效果檢查是用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在相關(guān)的培養(yǎng)基上檢查檢查菌的生長(zhǎng)、形態(tài)及生化情況,與已知情況相符.兩種情況都合格,配制的培養(yǎng)基方可使用.