微生物分離純化及鑒定
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
微生物分離純化及鑒定
微生物鑒定是指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過對未知微生物的特征測定，對其進行細(xì)菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分，或?qū)?、種及菌株水平確定的過程，它是藥品微生物檢驗中的重要環(huán)節(jié)。
微生物鑒定需達(dá)到的水平視情況而定，包括 屬、 種鑒定和 菌株分型
常規(guī)特征分析（屬水平鑒定）
大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險評估中，對所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應(yīng)進行分析。
種水平鑒定
非無菌藥品產(chǎn)品的控制菌檢查應(yīng)達(dá)到種的水平
菌株分型
無菌試驗結(jié)果陽性和無菌生產(chǎn)模擬工藝失敗時，對檢出的微生物鑒定一般需達(dá)到菌株水平。
分離純化技術(shù)
獲得純培養(yǎng)物對微生物學(xué)研究至關(guān)重要， 平板劃線法是分離純化常用技術(shù)。
在劃線過程中，細(xì)胞逐漸分散，培養(yǎng)后可形成單個菌落。
成功獲得純培養(yǎng)物依賴于樣品中混合在一起的細(xì)胞是否有效的被相互分開。
初篩實驗
可能導(dǎo)致染色結(jié)果不理想的原因：
老齡培養(yǎng)物可能導(dǎo)致革蘭氏染色不確定，選用新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌；
過度加熱固著可能使革蘭氏陽性菌變?yōu)楦锾m氏陰性菌；
脫色劑使用過多會出現(xiàn)假陰性，使用太少有可能出現(xiàn)假陽性。
20210芽孢染色液
規(guī)格：10ml×4支/盒 ；包裝內(nèi)容：孔雀綠染色液 3支、番紅染色液1支
由于芽孢在結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分上均有別于營養(yǎng)細(xì)胞，所以芽孢也就具有了許多不同于營養(yǎng)細(xì)胞的特性。芽孢是整個生物界中抗逆性最強的生命體，對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強的抗性。
例如，肉毒梭菌的芽胞在沸水中要經(jīng)過5至9.5h才被殺死；巨大芽胞桿菌芽胞的抗輻射能力比E.coli細(xì)胞要強36倍。芽胞的休眠能力更為突出，在常規(guī)條件下，一般可以保持幾年至幾十年而不死。據(jù)文獻記載，有的芽胞甚至可以休眠數(shù)百至數(shù)千年，最極端的例子是在美國的一塊有2500萬~4000萬年歷史的琥珀，至今從其中蜜蜂腸道內(nèi)還可以分離到有生命的芽胞。
是否能消滅芽孢是衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標(biāo)。【50203枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌片：用于環(huán)氧乙烷滅菌效果檢測；50204嗜熱脂肪桿菌芽孢菌片 ：用于壓力蒸汽滅菌效果檢測】芽孢是細(xì)菌的休眠體，在適宜的條件下可以重新轉(zhuǎn)變成為營養(yǎng)態(tài)細(xì)胞；產(chǎn)芽孢細(xì)菌的保藏多用其芽孢。（如何獲得芽孢？）產(chǎn)芽孢的細(xì)菌多為桿菌，也有一些球菌。芽孢的有無、形態(tài)、大小和著生位置是細(xì)菌分類和鑒定中的重要指標(biāo)。芽孢與營養(yǎng)細(xì)胞相比化學(xué)組成存在較大差異，容易在光學(xué)顯微鏡下觀察。
50203枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌片使用方法：
①使用時將裝有菌片的小紙袋放在被滅菌的物品中心部位（每鍋放置菌片數(shù)按衛(wèi)生部規(guī)定或其它相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定）。
②滅菌后，無菌操作取出小紙袋中的菌片，投放到營養(yǎng)肉湯（產(chǎn)品編號 10204，按使用說明配制，分裝試管，5ml/支，滅菌后 4℃保存?zhèn)溆茫┲?。同時將兩片未經(jīng)滅菌的菌片分別投入兩管營養(yǎng)肉湯中作對照。
③37℃培養(yǎng) 7 天，觀察結(jié)果，對照管呈混濁：若滅菌后營養(yǎng)肉湯澄清透明，則為陰性，表示滅菌徹底；若滅菌后營養(yǎng)肉湯渾濁，則為陽性，表示滅菌不徹底。
④當(dāng)出現(xiàn)陽性結(jié)果時，為確定是否為滅菌后接種操作過程中操作不當(dāng)污染所致，可使用無菌操作取 0.2ml 營養(yǎng)肉湯涂布接種至營養(yǎng)瓊脂（產(chǎn)品編號 10103）平板上，置37℃培養(yǎng)48小時，涂片鏡檢或作進一步試驗。
⑤枯草芽孢桿菌為 G+桿菌，極易形成芽孢，芽孢位置位于菌體中央，不膨大。芽孢染色為孔雀綠著色。在營養(yǎng)瓊脂上菌落呈棕色并隨時間延長菌落逐漸著上黑色。
50204嗜熱脂肪桿菌芽孢菌片 ：
①使用時將裝有菌片的小紙袋放在被滅菌的物品中心部位（每鍋放置菌片數(shù)按衛(wèi)生部規(guī)定或其它相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定），視需要也可將小紙袋盛于試管等特定容器中再進行滅菌
②滅菌后，無菌操作取出小紙袋中的菌片，投放到溴甲酚紫蛋白胨培養(yǎng)液（產(chǎn)品編號 10114，按使用說明配制，分裝試管，5ml/支，滅菌后 4℃保存?zhèn)溆?。）中。同時將未經(jīng)滅菌的菌片投入另一管培養(yǎng)液中作對照。
③56℃±1℃培養(yǎng) 48 小時，觀察結(jié)果，對照管呈黃色：若滅菌后菌片培養(yǎng)液呈紫色，則陰性，表示滅菌徹底；若滅菌后菌片培養(yǎng)液呈黃色，則為陽性，表示滅菌不徹底。
④嗜熱脂肪芽孢桿菌為 G+桿菌，芽孢染色為孔雀綠著色。
其他染色技術(shù)
抗酸染色；鞭毛染色；內(nèi)含物-異染粒染色
接種：用1小環(huán)（外徑1.5毫米的接種環(huán)）的肉湯菌液，穿刺接種到培養(yǎng)基中，穿刺到管底。30℃培養(yǎng)，分別在3至7天觀察結(jié)果。
結(jié)果觀察：如細(xì)菌在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。
5、生化篩選實驗
1)氧化酶試驗：（20202）
用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭氏陰性桿菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）
原理：氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。
操作：暗室中，使用無菌鑷子取出一張紙片，滴加 1 滴無菌生理鹽水浸濕，挑取新鮮的待
檢菌苔涂抹于紙片上，1 分鐘內(nèi)紙片變紫則為陽性。試驗副溶血性弧菌為陽性，大腸埃希氏菌為陰性
應(yīng)用：腸桿菌科氧化酶陰性，非發(fā)酵菌氧化酶陽性（個別除外），弧菌科，奈瑟菌屬、莫拉菌屬陽性。
注：本品見光易變質(zhì)，請于暗室保存，使用時避免遇強光；待檢菌苔必須是新鮮的，且無雜菌，否則極易造成誤判
2)過氧化氫酶試驗（20706）
原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和原子態(tài)氧，繼而形成分子氧，出現(xiàn)氣泡。
操作：接種環(huán)挑取培養(yǎng)24 h菌種一環(huán)，涂抹于滴有3% H2O2 的玻片上。
應(yīng)用：革蘭氏陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群。
3)凝固酶試驗
凝固酶 ：致病性葡萄球菌大多能產(chǎn)生凝固酶，非致病葡萄球菌不產(chǎn)生此酶。凝固酶分為結(jié)合型和游離型兩種。
結(jié)合型凝固酶：結(jié)合在細(xì)胞壁，與纖維蛋白原結(jié)合，使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，引起細(xì)菌凝集，采用玻片法檢測；
游離型凝固酶：分泌至細(xì)菌體外，被血漿中凝固酶反應(yīng)因子激活，形成葡萄球菌凝血酶，使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，導(dǎo)致血漿凝固，采用試管法檢測。
操作：
玻片法——取潔凈玻片一張，滴加兔血漿（20802）一滴；用接種環(huán)取實驗菌苔一環(huán)，在兔血漿中研磨混勻；結(jié)果觀察：如出現(xiàn)顆粒狀凝集現(xiàn)象即為血漿凝固酶實驗陽性。如不立即發(fā)生凝集，可輕搖玻片加速反應(yīng)，若仍無凝集則為陰性。
試管法——取肉湯培養(yǎng)物0.5ml同0.5ml兔血漿于試管內(nèi)充分混合，置 36±1℃培養(yǎng)；定時觀察是否有凝塊形成,至少觀察6 h,以內(nèi)容物完全凝固,使試管倒置或傾斜時不流動者為陽性。
陽性對照：金黃色葡萄球菌
兔血漿&凍干兔血漿
4)碳水化合物氧化和發(fā)酵
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或
產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。
實驗方法：
以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。
接種后，置36±1℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。