微生物分離純培養(yǎng)技術(shù)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其他微生物污染的技術(shù)被稱(chēng)為無(wú)菌技術(shù)（aseptic technique），它是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵。
試管、玻璃燒瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最為常用的培養(yǎng)微生物的器具，在使用前必須先行滅菌，使容器中不含任何生物。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過(guò)，而空氣中的其他微生物不能通過(guò)。而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專(zhuān)為防止空氣中微生物的污染 用接種環(huán)或接種針?lè)蛛x微生物，或在無(wú)菌條件下把微生物由一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，是微生物學(xué)研究中最常用的基本操作。由于打開(kāi)器皿就可能引起器皿內(nèi)部被環(huán)境中的其他微生物污染，因此微生物實(shí)驗(yàn)的所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，。操作箱或操作室內(nèi)的空氣可在使用前一段時(shí)間內(nèi)用紫外燈或化學(xué)藥劑滅菌。有的無(wú)菌室通無(wú)菌空氣維持無(wú)菌狀態(tài)。用以挑取和轉(zhuǎn)接微生物材料的接種環(huán)及接種針，一般采用易于迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金等金屬制備，使用時(shí)用火焰灼燒滅菌。而移植液體培養(yǎng)物可采用無(wú)菌吸管或移液槍。
不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類(lèi)、鑒定的重要依據(jù)（圖2-3）。大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、以及許多真菌和單細(xì)胞藻類(lèi)能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。
最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，100多年來(lái)一直是各種菌種分離的最常用手段。 先將待分離的材料用無(wú)菌水作一系列的稀釋?zhuān)ㄈ?:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50?左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。
由于將含菌材料先加到還較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。 用接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線(xiàn)、扇形劃線(xiàn)或其他形式的連續(xù)劃線(xiàn)，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線(xiàn)次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線(xiàn)適宜的話(huà)，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。 對(duì)于那些對(duì)氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進(jìn)*行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式 。先將一系列盛無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50?左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)嚬苎杆贀u動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開(kāi)。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。
并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，例如一些細(xì)胞大的細(xì)菌、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來(lái)獲得純培養(yǎng)。 通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過(guò)95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。 采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱(chēng)為單細(xì)胞（或單孢子）分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類(lèi)、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的細(xì)菌則較難。
如果某種微生物的生長(zhǎng)需要是已知的，也可以設(shè)計(jì)一套特定環(huán)境使之特別適合這種微生物的生長(zhǎng)，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來(lái)，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過(guò)選擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱(chēng)為選擇培養(yǎng)分離。在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多數(shù)場(chǎng)合下微生物群落是由多種微生物組成的，因此，要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其它微生物相比非常少時(shí)，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。
主要根據(jù)待分離微生物的特點(diǎn)選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，微生物生長(zhǎng)時(shí)若產(chǎn)生蛋白酶則會(huì)水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈。通過(guò)菌株培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解圈對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行篩選，可以減少工作量，將那些大量的非產(chǎn)蛋白酶菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進(jìn)行分離；有些微生物如螺旋體、粘細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動(dòng)特點(diǎn)進(jìn)行分離純化，因?yàn)榛心苁顾鼈冏约汉推渌荒芤苿?dòng)的微生物分開(kāi)?？蓪⑽⑸锶郝潼c(diǎn)種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復(fù)進(jìn)行，得到純培養(yǎng)物。
主要是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫外線(xiàn)、高壓、光照、氧氣、營(yíng)養(yǎng)等等許多方面。
富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。營(yíng)養(yǎng)和生理?xiàng)l件的幾乎無(wú)窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。 如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識(shí)的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱(chēng)為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的最有效途徑，因?yàn)椴《臼羌?xì)胞生物的嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。有一些具有細(xì)胞的微生物也是嚴(yán)格的其它生物的細(xì)胞內(nèi)寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對(duì)于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實(shí)驗(yàn)室控制條件下可能達(dá)到的最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。
七、微生物的保藏技術(shù)
傳代培養(yǎng)與培養(yǎng)物的直接使用密切相關(guān)，是進(jìn)行微生物保藏的基本方法。常用的有瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)等。采用傳代法保藏微生物應(yīng)注意針對(duì)不同的菌種而選擇使用適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行移種，以免由于菌株接種后不生長(zhǎng)或超過(guò)時(shí)間不能接活，喪失微生物菌種。在瓊脂斜面上保藏微生物的時(shí)間因菌種的不同而有較大差異,有些可保存數(shù)年，而有些僅數(shù)周。
將微生物處于冷凍狀態(tài)，使其代謝作用停止以達(dá)到保藏的目的。大多數(shù)微生物都能通過(guò)冷凍進(jìn)行保存，細(xì)胞體積大者要比小者對(duì)低溫更敏感，而無(wú)細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁者敏感。 一般來(lái)說(shuō)，保藏溫度越低，保藏效果越好。在常用的冷凍保藏方法中，液氮保藏可達(dá)到—196?。因此，從適用的微生物范圍、存活期限、性狀的穩(wěn)定性等方面來(lái)看，該方法在迄今使用的各種微生物保藏方法中是較理想的一種。
沙土管保存和冷凍真空保藏是最常用的二項(xiàng)微生物干燥保藏技術(shù)。前者主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線(xiàn)菌等。一般將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長(zhǎng)出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入無(wú)菌的沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。
冷凍真空保藏是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過(guò)冰的升華作用除去水分。達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動(dòng)處于休眠，可以達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。
除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方法還有很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對(duì)不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒(méi)有一種方法能被證明對(duì)所有的微生物均適宜。
將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。
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在實(shí)驗(yàn)室或工廠(chǎng)實(shí)踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。
1.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀
常用的接種方法有以下幾種：
1）劃線(xiàn)接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線(xiàn)形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線(xiàn)中就常用此法。 2）三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀(guān)察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。 3）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線(xiàn)穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線(xiàn)周?chē)軌蛏L(zhǎng)。 4）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45?C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。 5）涂布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。 6）液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱(chēng)為液體接種。 7）注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。 8）活體接種 活體接種是專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。
2 培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。
實(shí)驗(yàn)臺(tái)面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時(shí)利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方，空氣流動(dòng)應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量減少，其周?chē)s菌也應(yīng)越少越好。為此，必須清掃室內(nèi)，關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的門(mén)窗，并用消毒劑進(jìn)行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量。
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空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時(shí)，打開(kāi)培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來(lái)回通過(guò)火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來(lái)挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖3-4）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過(guò)火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開(kāi)一小部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過(guò)。
（1）接種滅菌 （2）開(kāi)啟棉塞 （3）管口滅菌 （4）挑起菌苔 （5）接種 （6）塞好棉塞 含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱(chēng)為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱(chēng)為純培養(yǎng)（Pure culture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱(chēng)為分離純化，方法有許多種。
1 首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋?zhuān)∫欢康南♂屢号c熔化好的保持在40~50?左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。
1.菌懸液 2.熔化的培養(yǎng)基 3.培養(yǎng)物 4.無(wú)菌水
2、涂布平板法
首先把微生物懸液通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)∫欢康南♂屢悍旁跓o(wú)菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無(wú)菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。
3、平板劃線(xiàn)法
最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線(xiàn)法。用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線(xiàn)。劃線(xiàn)的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線(xiàn)方法有斜線(xiàn)法、曲線(xiàn)法、方格法、放射法、四格法等。當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋?zhuān)詈笤谒鶆澋木€(xiàn)上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落。
4、富集培養(yǎng)法
富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落。如果要分離一些專(zhuān)性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。
1.斜線(xiàn)法 2.曲線(xiàn)法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
5、厭氧法
在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。
微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、PH等。微生物的種類(lèi)不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。
1、影響微生物生長(zhǎng)的因素 微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長(zhǎng)的因素很多，簡(jiǎn)要介紹如下。
1） 營(yíng)養(yǎng)物濃度
細(xì)菌的生長(zhǎng)率與營(yíng)養(yǎng)物的濃度有關(guān)：μ=μmax*C/（K+C） 營(yíng)養(yǎng)物濃度與生長(zhǎng)率的關(guān)系曲線(xiàn)是典型的雙曲線(xiàn)。 K值是細(xì)菌生長(zhǎng)的很基本的特性常數(shù)。它的數(shù)值很小，表明細(xì)菌所需要的營(yíng)養(yǎng)濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長(zhǎng)。然而營(yíng)養(yǎng)太低時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)就會(huì)遇到困難，甚至還會(huì)死亡。這是因?yàn)槌松L(zhǎng)需要能量以外，細(xì)菌還需要能量來(lái)維持它的生存。這種能量稱(chēng)為維持能。另一方面，隨著營(yíng)養(yǎng)物濃度的增加，生長(zhǎng)率愈接近最大值。
2）溫度
在一定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)：最低生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度。在生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)內(nèi)，微生物都能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速率不一樣。微生物只有處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度才最快，代時(shí)最短。超過(guò)最低生長(zhǎng)溫度，微生物不會(huì)生長(zhǎng)，溫度太低，甚至?xí)劳?。超過(guò)最高生長(zhǎng)溫度，微生物也要停止生長(zhǎng)，溫度過(guò)高。也會(huì)死亡。一般情況下，每種微生物的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)是恒定的。但也常受其它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。 根據(jù)微生物最適生長(zhǎng)溫度的不同，可將它們分為三個(gè)類(lèi)型：
a.嗜冷微生物：其是適生長(zhǎng)溫度多數(shù)在-10-20攝氏度之間。 b.中溫微生物：其最適生長(zhǎng)溫度一般在20-45攝氏度之間。c.嗜熱微生物：生長(zhǎng)溫度在45?以上。
3）水分
水分是微生物進(jìn)行生長(zhǎng)的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長(zhǎng)，而不能生活在純水中。各種微生物在能生長(zhǎng)發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。
4）氧氣
按照微生物對(duì)氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個(gè)類(lèi)型。
a. 需氧微生物
這類(lèi)微生物需要氧氣供呼吸之用。沒(méi)有氧氣，便不能生長(zhǎng)，但是高濃度的氧氣對(duì)需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長(zhǎng)。絕大多數(shù)微生物都屬于這個(gè)類(lèi)型。
b. 兼性需氧微生物
這類(lèi)微生物在有氧氣存在或無(wú)氧氣存在情況下，都能生長(zhǎng)，只不過(guò)所進(jìn)行的代謝途徑不同罷了。在無(wú)氧氣存在的條件下，它進(jìn)行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無(wú)氧乙醇發(fā)酵。
c. 微量需氧微生物
這類(lèi)菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長(zhǎng)最好。這可能是由一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。
d. 耐氧微生物
這類(lèi)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會(huì)被氧氣所殺死。
c. 厭氧微生物
這類(lèi)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中，不需要分子氧。分子氧存在對(duì)它們生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害，不是被抑制，就是被殺死。
2
1）根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類(lèi)。
好氧培養(yǎng)：也稱(chēng)“好氣培養(yǎng)”.就是說(shuō)這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長(zhǎng)良好。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過(guò)棉花塞從外界獲得無(wú)菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過(guò)搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。
厭氧培養(yǎng)：也稱(chēng)“厭氣培養(yǎng)”.這類(lèi)微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：
a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長(zhǎng)。
b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒(méi)食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。
c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。
d.替代驅(qū)氧 用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮?dú)怛?qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣
體驅(qū)代氧氣。
2）根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類(lèi)。
固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營(yíng)養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)的方法。
液體培養(yǎng)：在實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。