微生物的分離純化與無(wú)菌操作
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
配置好的生物培養(yǎng)基
土壤的稀釋分離,純化微生物及無(wú)菌操作技術(shù)
實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的:學(xué)習(xí)從土壤中分離微生物的方法,學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù).
用稀釋法分離細(xì)菌,放線菌和霉菌.
用平板劃線方法分離微生物.
學(xué)習(xí)斜面接種及穿刺接種等無(wú)菌操作技術(shù).
實(shí)驗(yàn)材料和用具
金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和普通變形菌(Proteusvulgaris)斜面菌種.
已滅菌的牛肉膏,高氏1號(hào),土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶,49.5毫升無(wú)菌水(帶玻璃珠)1瓶,4.5毫升無(wú)菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.
無(wú)菌培養(yǎng)皿12套,1毫升無(wú)菌移液管10支,土壤樣品及天平,稱量紙,藥勺,試管架,玻璃鉛筆,橡皮頭(用75%乙醇浸泡),玻璃刮.
操作步驟
土壤稀釋分離
取土壤取表層以下5至10厘米處的土樣,放入無(wú)菌的袋中備用,或放在4攝氏度冰箱中
暫存.
制備稀釋液(要無(wú)菌操作)
制備土壤懸液:稱土樣0.5g,迅速倒入帶玻璃珠的49.5毫升無(wú)菌水瓶中(玻璃珠用量
以充滿瓶底力最好),振蕩5至10分鐘,使土樣充分打散,即成為10-2的土壤懸液.
稀釋:用無(wú)菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5毫升,放入4.5毫升無(wú)菌水中即為10-3
稀釋液,如此重復(fù),可依次制成10-3至10-8的稀釋液.注意:操作時(shí)管尖不能接觸液面,每一個(gè)稀釋度換用一支移液管,每次吸入土液后,要將移液管插入液面,吹吸3次,每次吸上的液面要高于前一次,以減少稀釋中的誤差.
混菌法測(cè)定菌落數(shù)的方法
細(xì)菌:取10-7,10-6兩管稀釋液各1毫升,分別接人相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中,每個(gè)稀釋度接
兩個(gè)平皿.然后取冷卻至50攝氏度的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基,分別倒入以上培養(yǎng)皿中(裝量以鋪滿皿
底高1.5至2mm為宜),迅速輕輕搖動(dòng)平皿,使菌液與培養(yǎng)基充分混勻,但不沾濕皿的邊緣,
待瓊脂凝固即成細(xì)菌平板.倒平板時(shí)要注意無(wú)菌操作.
放線菌:取10-5,10-4兩管稀釋液,在每管中加入10%酚液5至6滴,搖勻,靜置
片刻,然后分別從兩管中吸出1毫升加入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中,選用高氏1號(hào)培養(yǎng)基,用與細(xì)菌相同的方法倒入平皿中,便可制成放線菌平板.
霉菌:取10-2,10-3兩管稀釋各1毫升,分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中,每個(gè)稀釋度
接兩個(gè)平皿.在融化的土豆蔗糖培養(yǎng)基中,每100毫升加入滅菌的乳酸1毫升,輕輕搖勻,然后用與細(xì)菌相同的方法倒入平皿中,便可制成霉菌的平板.
培養(yǎng)將接種好的細(xì)菌,放線菌,霉菌平板倒置,即皿蓋朝下放置,于28至30攝氏度中
恒溫培養(yǎng),細(xì)菌培養(yǎng)1至2d,放線菌培養(yǎng)5至7d,霉菌培養(yǎng)3至5d.觀察生長(zhǎng)的菌落,用于
進(jìn)一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面.
劃線分離使用接種環(huán),從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣,在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離,劃線的方法多樣,目的是獲得單個(gè)菌落.
培養(yǎng)方法同“土壤稀釋分離”.
斜面接種和穿刺接種
斜面接種
取新鮮固體斜面培養(yǎng)基,分別做好標(biāo)記(寫(xiě)上菌名,接種日期,接種人等),然后用無(wú)菌操作方法,把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜面上.
接種的方法是,用接種環(huán)沾取少量待接菌種,然后在新鮮斜面上“之”字形劃線,方向是從下部開(kāi)始,一直劃至上部.注意劃線要輕,不可把培養(yǎng)基劃破.
接種后30攝氏度恒溫培養(yǎng),細(xì)菌培養(yǎng)48h,放線菌,霉菌培養(yǎng)至孢子成熟方可取出保存.
穿刺接種
取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養(yǎng)基,做好標(biāo)記(寫(xiě)上菌名),接種日期,接種人等).
接種的方法是,用接種針沾取少量待接菌種,然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部(但不要穿透),然后沿原刺入路線抽出接種針,注意接種針不要移動(dòng).
接種后30攝氏度恒溫培養(yǎng),24h后觀察,比較兩種菌的生長(zhǎng)結(jié)果.
注意事項(xiàng)
一般土壤中,細(xì)菌最多,放線菌及霉菌次之,而酵母菌主要見(jiàn)于果園及菜園土壤中,故從土壤中分離細(xì)菌時(shí),要取較高的稀釋度,否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù).
在土壤稀釋分離操作中,每稀釋10倍,最好更換一次移液管,使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確.
放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多.
實(shí)驗(yàn)報(bào)告
記錄土壤稀釋分離結(jié)果,并計(jì)算出每克土壤中的細(xì)菌,放線菌和霉菌的數(shù)量.
計(jì)算方法:選擇長(zhǎng)出菌落數(shù)30至300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù),按以下公式:
總菌數(shù)/g=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)
分別記錄平板劃線,斜面接種的結(jié)果,并自我評(píng)價(jià).
比較兩種細(xì)菌穿刺接種的結(jié)果,并進(jìn)行分析.
問(wèn)題和思考
在測(cè)定土壤微生物含量中,除混菌法外還可用什么方法?
試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),從土壤中分離出酵母菌,并進(jìn)行計(jì)數(shù).
穿刺接種
取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養(yǎng)基,做好標(biāo)記(寫(xiě)上菌名),接種日期,接種人等).
接種的方法是,用接種針沾取少量待接菌種,然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部(但不要穿透),然后沿原刺入路線抽出接種針,注意接種針不要移動(dòng).
接種后30攝氏度恒溫培養(yǎng),24h后觀察,比較兩種菌的生長(zhǎng)結(jié)果.
注意事項(xiàng)
一般土壤中,細(xì)菌最多,放線菌及霉菌次之,而酵母菌主要見(jiàn)于果園及菜園土壤中,
故從土壤中分離細(xì)菌時(shí),要取較高的稀釋度,否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù).
在土壤稀釋分離操作中,每稀釋10倍,最好更換一次移液管,使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確.
放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多.
實(shí)驗(yàn)報(bào)告
記錄土壤稀釋分離結(jié)果,并計(jì)算出每克土壤中的細(xì)菌,放線菌和霉菌的數(shù)量.
計(jì)算方法:選擇長(zhǎng)出菌落數(shù)30至300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù),按以下公式:
總菌數(shù)/g=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)
分別記錄平板劃線,斜面接種的結(jié)果,并自我評(píng)價(jià).比較兩種細(xì)菌穿刺接種的結(jié)果,并進(jìn)行分析.