微生物菌種保藏原理及步驟
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
干粉培養(yǎng)基品牌
微生物菌種保藏
實(shí)驗(yàn)原理
甘油保藏方法；冷凍干燥保藏方法.
實(shí)驗(yàn)材料和用具
細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌斜面菌種.0.75%NaCl(生理鹽水),甘油,1.5毫升離心管1個(gè)/人.
操作步驟
下列各方法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做.
斜面?zhèn)鞔２胤?/span>
貼標(biāo)簽取各種無菌斜面試管數(shù)支,將注有菌株名稱和接種日期標(biāo)簽貼上,貼在試管斜面的正上方,距試管口2-3cm處.
斜面接種將待保藏的菌種用接種環(huán)以無菌操作法移接至相應(yīng)的試管斜面上,細(xì)菌和酵母菌宜采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,而放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的孢子.
培養(yǎng)細(xì)菌37攝氏度恒溫培養(yǎng)18-24h,酵母菌于28-30攝氏度培養(yǎng)36-60h,放線菌和絲狀真置于28攝氏度培養(yǎng)4-7d.
保藏斜面長(zhǎng)好后,可直接放入4攝氏度冰箱保藏.為防止棉塞受潮長(zhǎng)雜菌,管口棉花應(yīng)用牛皮紙包扎,或換上無菌膠塞,亦可用熔化的固體石蠟熔封棉塞或膠塞.
保藏時(shí)間依微生物種類而不同,酵母菌每4-6個(gè)月移種一次、霉菌每6個(gè)月移種一次、放線菌每3個(gè)月移種一次及有芽孢的細(xì)菌每2-6個(gè)月移種一次,而不產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌最好每月移種一次.此法的缺點(diǎn)是容易變異,污染雜菌的機(jī)會(huì)較多.因此不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長(zhǎng)期保藏.
液體石蠟保藏法
液體石蠟滅菌在250毫升三角瓶這裝入100毫升液體石蠟,塞上棉塞,并用牛皮紙包扎,121濕熱滅菌30分鐘于40攝氏度溫箱這放置14d(或置于105-110攝氏度烘箱中1h),或160攝氏度干熱滅菌1-2h,以除去石蠟中的水分,備用.
接種培養(yǎng)同斜面?zhèn)鞔２胤?
加液體石蠟用無菌滴管吸取液體石蠟以無菌操作加到已長(zhǎng)好的菌種斜面上,加入量以高出斜面頂端約1cm為宜.
保藏棉塞外包牛皮紙(可換成橡皮塞),將試管直立放置于4攝氏度冰箱中保存.
利用這種保藏方法,霉菌、放線菌、有芽孢細(xì)菌可保藏2年左右,酵母菌可保藏1-2年,一般無芽孢細(xì)菌可保藏1年左右.以該法保藏時(shí),應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn),可能某些菌株如酵母、霉菌、細(xì)菌等能利用石蠟為碳源,還有些對(duì)該法敏感,為預(yù)防不測(cè),一般保藏菌株2-3年應(yīng)做一次存活試驗(yàn).細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜使用該法.
恢復(fù)培養(yǎng)用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種,在試管壁上輕靠幾下,盡量使油滴凈,再接種于新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng).由于菌體表面粘有液體石蠟,生長(zhǎng)較慢且有粘性,故一般須轉(zhuǎn)接2次才能獲得良好菌種.
生理鹽水保藏法.取純氯化鈉0.7-0.9克,放入100%毫升蒸餾水中,攪拌均勻分裝試管,每管5-10毫升,進(jìn)行滅菌(1公斤/平方厘米,30分鐘),經(jīng)無菌檢查合格后備用,將待保藏的菌種接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中適溫振蕩培養(yǎng)5-7天.無菌操作吸取少許培養(yǎng)菌種注入經(jīng)檢驗(yàn)合格的生理鹽水試管中,塞上無菌橡皮塞,用石蠟涂封,在室溫或低溫保藏.
沙土保藏法
沙土處理
沙處理：取河沙經(jīng)40目過篩,去除大顆粒,加10%HCL浸泡(用量以浸沒沙面為宜)2-4h (或煮沸30分鐘),以去除有機(jī)雜質(zhì),然后倒去鹽酸,用清水沖洗至中性,烘干或曬干,備用.
土處理：取耕作層瘦黃土(不含有機(jī)質(zhì)),加自來水浸泡洗滌數(shù)次,直至中性,然后烘干,粉碎,用100目過篩,去除粗顆粒后備用.
裝沙土管將沙與土按2﹕1,3﹕1或4﹕1(W／W)比例混合均勻裝入試管中(10毫米×100毫米),裝置約7cm高,加棉花塞,并外包牛皮紙,121攝氏度濕熱滅菌30分鐘,然后烘干.
無菌試驗(yàn)每10土管任抽一支,取少許沙土放入牛肉膏蛋白胨或麥芽汁培養(yǎng)液中,在最適的溫度下培養(yǎng)2-4d ,確定無菌生長(zhǎng)時(shí)可使用.若發(fā)現(xiàn)有雜菌,經(jīng)重新滅菌,再作無菌試驗(yàn),直到合格.
制備菌液用5毫升無菌吸管分別吸取3毫升無菌水至待保藏的菌種斜面上,用接種環(huán)輕輕攪動(dòng),制成懸液.
加樣用1毫升吸取上述菌懸液0.1-0.5毫升加入士管中,用接種環(huán)抖勻.加入菌液量以濕潤(rùn)沙土達(dá)2／3高度為宜.
干燥將含菌的沙土管放入干燥器中,干燥器內(nèi)用培養(yǎng)皿P2O5作為干燥劑,可再用真空泵連續(xù)抽氣3-4h加速干燥.將沙土管輕輕一拍,沙土呈分散狀即達(dá)到充分干燥.
保藏沙土管可選擇下列方法之一來保藏：
保存于干燥器中；
用石蠟封住棉花塞后放入冰箱保存；
將沙土管取出,管口用火焰熔封后面入冰箱保存；
將沙土管裝入有CaCl2等干燥劑的大試管中,塞上橡皮塞或木塞,再用蠟封口,放入冰箱中或室溫下保存.
恢復(fù)培養(yǎng)使用時(shí)挑少量混有孢子的沙土,接種于斜面培基上,或液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)即可,原沙土管仍可繼續(xù)保藏.
此法適用于保藏能產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌及形成孢子的霉菌和放線菌,可保存2年左右.但不能用于保藏營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞.
冷凍保藏法
普通冷凍保藏法(-20攝氏度)
將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分別接到試管或指管內(nèi),嚴(yán)格密封后置于冰箱保藏.該法簡(jiǎn)單易行,但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏.
超低溫冷凍保藏法
離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞,再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞,保存時(shí)菌液加量不宜過多,后加入等體積的20%甘油或10%二甲亞砜冷凍保護(hù)劑,混勻后分裝入指管,于-70攝氏度冰箱保藏.若干細(xì)菌和真菌可用該法保藏5年而活力不受影響.取用冷凍保存的菌種時(shí),應(yīng)采取速融措施,即在35-40攝氏度溫水中輕輕振蕩使之迅速融解.當(dāng)冷凍菌融化后,應(yīng)盡量避免再次冷凍,否則菌體的存活率將顯著下降.
液氮冷凍保藏法
把細(xì)胞懸浮于一定分散劑中或?qū)?a href="http://m.ricoportland.com/products_list/keyword=%25E7%2590%25BC%25E8%2584%2582%25E5%259F%25B9%25E5%2585%25BB%25E5%259F%25BA&method=submit&searchType=1.html" target="_blank">瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌種直接進(jìn)行液氮冷凍,后移至液氮(-196攝氏度)或其蒸汽相中(-156攝氏度)
冷凍干燥保藏法
準(zhǔn)備安瓿管→制備脫脂牛奶→準(zhǔn)備菌種→制備菌液及分裝→預(yù)凍→真空干燥→封口→恢復(fù)培養(yǎng)
冷凍干燥保藏法綜合利用了各種有利于菌種保藏的因素(低溫、干和缺氧等),是目前最有效的菌種保藏方法之一.保存時(shí)間可達(dá)10年以上.
注意事項(xiàng)
從液體石蠟封藏的菌種管中挑菌后,接種環(huán)上帶有油和菌,故接種環(huán)在火焰滅菌時(shí)要先在火焰邊烤干再直接灼燒,以免菌液四濺,引起污染.
真空干燥過程中安瓿管內(nèi)樣品應(yīng)保持凍結(jié)狀態(tài),以防止抽真空時(shí)樣品產(chǎn)生泡沫而外溢.
熔封安瓿管時(shí)注意火焰大小要適中,封口處灼燒要均勻,若火焰過大,封口處易彎斜,冷卻后易出現(xiàn)裂縫而造成漏氣.
按以下項(xiàng)目列表記錄菌種保藏方法和結(jié)果.