微生物菌種保藏方法
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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微生物菌種保藏方法
傳代保存法:有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時(shí),會(huì)很快死亡,因此在這種情況下,只能求助于傳代培養(yǎng)保存法.傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存.
傳代保存時(shí),培養(yǎng)基的濃度不宜過(guò)高,營(yíng)養(yǎng)成分不宜過(guò)于豐富,尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低.培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長(zhǎng)溫度為好.若為產(chǎn)酸菌種,則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣.
一般地,大多數(shù)菌種的保藏溫度以5攝氏度為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37攝氏度進(jìn)行保存,而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存.
傳代培養(yǎng)保存法雖然簡(jiǎn)便,但其缺點(diǎn)也很明顯,如:菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉;菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異;反復(fù)傳代時(shí),菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低;需要定期轉(zhuǎn)種,工作量大;雜菌的污染機(jī)會(huì)較多.
液體石蠟覆蓋保存法:該法較前一種方法保存菌種的時(shí)間更長(zhǎng),適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細(xì)菌等的保存.此法可防止干燥,并通過(guò)限制氧的供給而達(dá)到削弱微生物代謝作用的目的.其具有方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌)的保存,而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存.
載體保存法:即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法.常用的有方法包括以下幾種,如
土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏.方法是在滅菌的土壤中加入菌液,立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥,然后冷藏或在室溫下密封保存.保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,土壤需風(fēng)干、粉碎、過(guò)篩和滅菌.
使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是:取適量土壤(5克)置于塞有棉塞的試管中,加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜),然后高壓滅菌.再將需保存的微生物進(jìn)行大量接種,培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認(rèn)的程度為止,移入干燥器中經(jīng)短時(shí)間干燥或風(fēng)干后密封,冷藏或室溫保存.
砂土保存法:取清潔的砂,過(guò)60目篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數(shù)次,干燥后,置于試管或安瓶管中保持2至3厘米深,再經(jīng)干熱滅菌后,加入1毫升菌種培養(yǎng)液,經(jīng)充分混勻后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存.也可用二份洗凈的砂(經(jīng)HCl預(yù)處理)和一份貧瘠、過(guò)篩的黃土攙和后滅菌,再進(jìn)行菌種保藏.
硅膠保存法:以6至16目的無(wú)色硅膠代替砂子,干熱滅菌后,加入菌液.加菌液時(shí),由于硅膠的吸附熱常使溫度升高,因而需設(shè)法加以冷卻.
磁珠保存法:將菌液浸入素?zé)胖?或多孔玻璃珠)后再進(jìn)行干燥保存的一種方法.在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無(wú)水CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上10至20粒磁珠,經(jīng)干熱滅菌后,接入菌懸液,最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏.本法對(duì)酵母菌很有效,特別適用于根瘤菌,可保存長(zhǎng)達(dá)兩年半時(shí)間.
麩皮保存法:在麩皮內(nèi)加入60%的水,經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng),最后干燥保藏.
紙片(濾紙)保存法:將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中,常壓或減壓干燥后,置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進(jìn)行保存.
懸液保存法:即使微生物混懸于適當(dāng)溶液中進(jìn)行保存的方法.常用的有,
蒸餾水保存法:適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年.本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā).
糖液保存法:適用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗處保存,可長(zhǎng)達(dá)10年.除此之外,也可使用緩沖液或食鹽水等進(jìn)行保存.
寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法.
冷凍保存法:適用于抗凍力強(qiáng)的微生物.這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷,而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言,無(wú)論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié),都會(huì)對(duì)菌體造成損傷,因此當(dāng)采用這種保藏方法時(shí),應(yīng)注意以下幾點(diǎn),
要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞;
要選擇適宜的培養(yǎng)基,因?yàn)槟承┪⑸飳?duì)冷凍的抵抗力,常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異;
要選擇合適的菌液濃度,通常菌液濃度越高,生存率越高,保存期也越長(zhǎng);
最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等);
可在菌液內(nèi)添加甘油等保護(hù)劑,以防止在冷凍過(guò)程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象.同樣,也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑,但對(duì)有些微生物而言,不加保護(hù)劑時(shí)更有效.
原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理,但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí),可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理.
就動(dòng)物細(xì)胞而言,應(yīng)在－20攝氏度范圍內(nèi)以1攝氏度/min左右的速度緩慢降溫,此后必須盡快降到貯藏溫度;而對(duì)絕大多數(shù)微生物而言,則不必如此,如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在－35攝氏度范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫,而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍;
若進(jìn)行長(zhǎng)期保存,則貯藏溫度越低越好;
取用冷凍保存的菌種時(shí),應(yīng)采取速融措施,即在35至40攝氏度溫水中輕輕振蕩使之迅速融解.而就厭氧菌來(lái)說(shuō),則應(yīng)選擇靜置融化的措施.當(dāng)冷凍菌融化后,應(yīng)盡量避免再次冷凍,否則菌體的存活率將顯著下降.
常用的冷凍保存法包括:
低溫冰箱保存法(－20攝氏度、－50攝氏度或－85攝氏度):低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜.保存時(shí)菌液加量不宜過(guò)多,有些可添加保護(hù)劑.此外,也可用φ5毫米的玻璃珠來(lái)吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi),再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的.
干冰保存法(－70攝氏度左右):即將菌種管插入干冰內(nèi),再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存.
液氮保存法(－196攝氏度):是適用范圍最廣的微生物保存法.其操作步驟如下,
裝安瓶管:使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中,將0.2至1毫升的這種溶液分裝于安瓶中,或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中.
熔封安瓶管:若直接貯存于氣相液氮中(－150攝氏度至－170攝氏度)時(shí),則不需熔封.
檢查安瓶管是否熔封良好:即在4攝氏度下,將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?至30分鐘后,觀察有無(wú)色素進(jìn)入安瓶.
緩慢冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮?dú)庖约s1攝氏度/min的速度冷卻至－25攝氏度左右,也可在－20攝氏度至－25攝氏度的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30至60min.
速冷:最后浸入液氮中快速冷卻至－196攝氏度.
冷凍干燥保存法:其原理是首先將微生物冷凍,然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分.事實(shí)上,從菌體中除去大部分水分后,細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止,因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的.該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存.
在進(jìn)行冷凍干燥時(shí),需注意以下幾個(gè)問(wèn)題:
冷凍干燥前的培養(yǎng)條件:首先檢驗(yàn)菌種純度.一般地說(shuō),將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜;菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好;若為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好;菌液濃度以高為好,如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109至1010/毫升.
菌株號(hào)碼等的標(biāo)記:可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封入標(biāo)簽.
安瓶的準(zhǔn)備:將安瓶在2%HCl中浸泡過(guò)夜,自來(lái)水沖洗3次后,蒸餾水刷凈,干燥,塞棉塞,貼標(biāo)簽,干熱滅菌或溫?zé)釡缇?60攝氏度恒溫干燥.
添加保護(hù)劑:常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等.
Bordelli氏法:取干凈的小試管(8×60毫米)塞上棉塞,滅菌.用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔,制成濃厚菌懸液.然后用無(wú)菌吸管將菌懸液滴入小試管底部.每管一滴,然后轉(zhuǎn)動(dòng)小試管使菌液分散在試管底部的壁上.標(biāo)記菌名.將小試管裝在15×150毫米的試管中,在大試管底部事先裝上1.5厘米高的(P2O5或KOH),管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,蠟封.將大試管與真空泵連通,抽真空至0.1至0.2毫米汞柱時(shí),將玻璃管熔封,置室溫暗處或冰箱保存.
儀器與材料
斜面菌種:絲狀真菌、酵母菌、芽孢桿菌和無(wú)芽孢桿菌各一支.
接種用具一套.
滅菌物品:1毫升、5毫升吸管,長(zhǎng)滴管,安瓶管,9毫升無(wú)菌水試管,砂土管,液體石蠟,脫脂牛乳.其中,液體石蠟的處理為1.5kg/厘米2壓力滅菌1小時(shí)或1kg/厘米2壓力滅菌3次,每次30分鐘.接著檢查是否徹底無(wú)菌,即接入肉湯中檢查有無(wú)雜菌生長(zhǎng).最后放在60至80攝氏度轟烤以去除水分.脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂,然后0.5kg/厘米2壓力滅菌20分鐘,或間歇滅菌3次,經(jīng)檢查無(wú)菌后備用.
P2O5,無(wú)水CaCl2各一瓶.
真空干燥器,真空泵.
方法
液體石蠟覆蓋法:取待保存的菌種斜面,用5毫升無(wú)菌吸管向內(nèi)加入滅菌石蠟,要求液體石蠟高出菌斜面1厘米左右,若不夠此高度,則常會(huì)引起斜面抽干現(xiàn)象.
砂土管法:用1毫升無(wú)菌吸管吸取0.2至0.5毫升菌懸液,滴入砂土管中,充分混勻后,將砂土管放入真空干燥器內(nèi),抽干,真空干燥器內(nèi)需放置無(wú)水CaCl2.最后,將干燥好的砂土管取出,迅速于火焰上蠟封管口,并在室溫下或冰箱中進(jìn)行保存.
冷凍干燥保藏法:
用滅菌長(zhǎng)滴管取出2滴(約0.1毫升)無(wú)菌脫脂牛乳,置于無(wú)菌安瓶管中,然后用另一支無(wú)菌滴管取出等體積的濃菌液,同樣置于此安瓶管中,充分混勻.
集中安瓶管,置于100毫升燒杯中,將燒杯裝進(jìn)真空冷凍干燥器的鐘罩內(nèi),開機(jī)并開冷卻水后,使菌液在－20攝氏度溫度下迅速凍結(jié)成固體,然后抽真空使水分升華,2小時(shí)后,可以停止冷凍并在稍高的溫度下進(jìn)行干燥,直至全干為止.
最后取出安瓶管,并將其與真空泵連接,再抽真空后,迅速將安瓶管熔封,最后冰箱保存.
甘油管保藏法:在5毫升菌種保藏管中,將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后,于－20攝氏度冰箱中保存.