艱難梭菌及其檢測(cè)技術(shù)
發(fā)布時(shí)間：
2022-11-16
作者：
做培養(yǎng)基好的廠家日水生物
艱難梭菌及其檢測(cè)技術(shù)
1.艱難梭菌簡(jiǎn)介
艱難梭菌又叫“艱難梭狀芽孢桿菌”,最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)30年代,是造成醫(yī)院感染和住院病患腹瀉的常見細(xì)菌.普通人群中約有3%的人的腸胃中都有這種細(xì)菌,在正常情況下,該細(xì)菌受制于人體內(nèi)的其他細(xì)菌,不會(huì)危害人體健康.但對(duì)于長期或是大量服用抗生素的病人而言,這種細(xì)菌是可怕的,甚至是致命的.這是由于藥物破壞了人體腸胃中各種菌類之間的平衡,所以容易導(dǎo)致“艱難梭菌”感染.就“艱難梭菌”本身而言,其致命性并不高,在0.6%到1.5%之間,但由于感染該細(xì)菌通常會(huì)伴隨偽膜性結(jié)腸炎的出現(xiàn),一旦出現(xiàn)這種情況,死亡率就會(huì)猛增到35%到50%.而且,與所有的細(xì)菌一樣,“艱難梭菌”會(huì)通過突變產(chǎn)生新的變種,而這些變種細(xì)菌的毒性和對(duì)人體的危害性、致命性通常也更強(qiáng)
2.艱難梭菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法
所有艱難梭菌菌株皆表達(dá)抗原谷氨酸脫氫酶,但是艱難梭菌分為產(chǎn)毒菌株和不產(chǎn)毒菌株兩種.僅產(chǎn)毒菌株分泌毒素A和毒素B.毒素A和毒素B都可以導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)疾病的發(fā)生.艱難梭菌的檢測(cè)主要是通過對(duì)疑似病例的糞便中毒素的檢測(cè)完成[1].直接糞便毒素測(cè)定包括細(xì)胞毒素測(cè)定(CTA)和酶免疫測(cè)定(EIA)[2].CTA中毒素B的檢測(cè)被認(rèn)為是艱難梭菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)
3.CTA涉及到將培養(yǎng)的細(xì)胞暴露到有或者沒有抗毒素存在的排泄抽提物中.如果排泄物樣本是艱難梭菌陽性,則對(duì)沒有經(jīng)過抗毒處理的培養(yǎng)細(xì)胞有毒害作用[4].
艱難梭菌也可以通過在厭氧條件下培養(yǎng)而被檢測(cè).這種方法具有很高的靈敏度,但是也很耗費(fèi)時(shí)間,需要超過三天的時(shí)間.另外,這種方法不能區(qū)分產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株.利用EIA對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)分離株進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試,主要是鑒定艱難梭菌菌株是否產(chǎn)毒[5].
傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的C.diff測(cè)驗(yàn)都是根據(jù)以下三種方法中的一種或者結(jié)合幾種進(jìn)行的:細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中的細(xì)胞毒素檢測(cè)；艱難梭菌毒素A、腸毒素、或者毒素A和毒素B的酶免疫測(cè)定(EIA)檢測(cè)；艱難梭菌的厭氧培養(yǎng).[6]
細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中的細(xì)胞毒素檢測(cè)
過濾的糞便抽提物加到微量滴定板上處于生長的健康的單層細(xì)胞中,培養(yǎng)48h.如果樣本中存在細(xì)胞毒素(一般是艱難梭菌毒素B),將會(huì)導(dǎo)致單層細(xì)胞聚集,脫離板(稱為細(xì)胞病變效應(yīng),CPE).非特定細(xì)胞毒素的鑒別是通過加入向第二個(gè)孔(孔內(nèi)有病人的糞便抽提物)加入特定的抗毒素(實(shí)際上是培育一種相似的微生物C.sordellii).只有起始的CPE是由于艱難梭菌毒素B引起的,在相應(yīng)的孔中抗毒素才會(huì)阻止CPE.一般認(rèn)為,細(xì)胞毒素中和(CTN)測(cè)定是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中最靈敏和精確的,但是存在兩個(gè)主要的缺點(diǎn):出結(jié)果的速度不夠快,從而影響了及時(shí)的臨床診斷；這種方法需要專業(yè)的技術(shù)和連續(xù)的組織培養(yǎng)[7].
艱難梭菌毒素A、腸毒素、或毒素A和毒素B的酶免疫測(cè)定(EIA)檢測(cè)
一些商業(yè)產(chǎn)品通過檢測(cè)在主要存在于有生長力的艱難梭菌細(xì)胞的一種蛋白質(zhì),叫谷氨酸脫氫酶(GDH),結(jié)合毒素檢測(cè).因?yàn)榧S便中的毒素易分解,特別是如果在轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室的過程中經(jīng)過耽誤,毒素測(cè)驗(yàn)很可能會(huì)錯(cuò)誤地成陰性,然而GDH是相當(dāng)穩(wěn)定的,通?？梢员砻魑⑸锏拇嬖?這種方法的缺點(diǎn)包括缺乏靈敏性,一些菌株毒素的改變使得不能被商業(yè)化產(chǎn)品檢測(cè)出來；一些無毒素的艱難梭菌也可分泌出GDH(假陽性結(jié)果)；一次進(jìn)行這些檢測(cè)的費(fèi)用；如果EIA測(cè)驗(yàn)是成批進(jìn)行以提高工作流程和成本效益,將會(huì)使周轉(zhuǎn)時(shí)間延長.
艱難梭菌的厭氧培養(yǎng)
培養(yǎng)是所有檢測(cè)中最靈敏的方法.但是必須進(jìn)行二次檢測(cè)以判斷產(chǎn)物毒素是否存在,因?yàn)榉嵌拘跃赀€是比較常見的.這就延長了出結(jié)果的周轉(zhuǎn)時(shí)間.另外,艱難梭菌的芽孢是極其堅(jiān)固的,但是有生長力的形式卻比較脆弱,必須維持厭氧環(huán)境以使其恢復(fù)生長.一種特殊的介質(zhì)——環(huán)絲氨酸-頭孢西丁果糖瓊膠(CCFA),必須在厭氧環(huán)境下儲(chǔ)存并培養(yǎng)48h,以達(dá)到最佳的恢復(fù).因?yàn)榕囵B(yǎng)技術(shù)的困難和結(jié)果輸出的延遲,在相對(duì)很少的檢測(cè)性實(shí)驗(yàn)室中會(huì)對(duì)艱難梭菌進(jìn)行培養(yǎng).早先的研究區(qū)分疾病通常包括在內(nèi)鏡檢查術(shù)下宏觀觀察粘膜的外觀,通過組織病理學(xué)比較(假膜是由剝落的細(xì)胞組成的白色或者黃色粗糙的物質(zhì)構(gòu)成),或者在結(jié)腸粘膜的活體組織上觀察到的的微觀病變.目前這種有擴(kuò)散性的檢測(cè)在今天已經(jīng)幾乎不被利用了,實(shí)驗(yàn)室測(cè)驗(yàn)是檢測(cè)的主要模式.這使得測(cè)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)的選擇至關(guān)重要.
最近已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了采用兩步方法后的更好的結(jié)果:對(duì)微生物本身非常靈敏的檢測(cè),首先利用EIA檢測(cè)GDH,緊接著對(duì)細(xì)胞毒素和中和的二次檢測(cè).因?yàn)樵谒胁∪说募S便標(biāo)本中的艱難梭菌,對(duì)GDH的快速檢測(cè)將都是陽性的,不管毒素的性質(zhì)是否已經(jīng)在運(yùn)輸過程中分解,這種方法是最靈敏的.糞便在其最初的檢測(cè)中被認(rèn)為是陰性的,即可立刻被報(bào)告時(shí)陰性的.因?yàn)榈谝粋€(gè)樣本是最有價(jià)值的.看護(hù)者可以進(jìn)行其他的檢測(cè)方法,并使得改變抗生素療法決定的立即必要性得到阻止.實(shí)驗(yàn)室必須繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞毒素測(cè)定,這使得周轉(zhuǎn)時(shí)間增加,或者培養(yǎng)和毒素測(cè)驗(yàn)的時(shí)間增加.然而,兩步方法是最有效的.
傳統(tǒng)檢測(cè)方法面臨的困境
無論是CTA還是艱難梭菌培養(yǎng)都需要耗費(fèi)大量時(shí)間和勞動(dòng)力.艱難梭菌檢測(cè)時(shí)間的延長將導(dǎo)致拖延對(duì)艱難梭菌陽性個(gè)體的治療；鑒定為假陽性可能導(dǎo)致使用抗生素應(yīng)對(duì)個(gè)體艱難梭菌感染.這也可能導(dǎo)致個(gè)體被誤診為艱難梭菌感染,而與真正艱難梭菌陽性病人共用同一間病房.
目前,一個(gè)更加致命的抗氟喹諾酮的限制性核酸內(nèi)切酶B1族艱難梭菌菌株在世界很多地方已經(jīng)被越來越多地檢測(cè)出來[8,9].這種新型菌株是通過其產(chǎn)物雙毒素(CDT)及毒素A和毒素B抑制劑基因位點(diǎn)tcdC的部分缺失加以區(qū)別的.
由于與新克隆相關(guān)的增加的致病率和死亡率,病菌的檢測(cè)迫在眉睫,因?yàn)榧紫踹虻男Яχ饾u下降,萬古霉素應(yīng)該盡可能地避免使用,甚至新的含益生菌的治療方法已經(jīng)流行起來[10,11].內(nèi)科醫(yī)生確實(shí)需要一種更加可信和效率的檢測(cè).
艱難梭菌的快速檢測(cè)方法
目前市場(chǎng)上有很多艱難梭菌快速檢測(cè)方法,其中以MeridianPremierC.difficileToxinA+BELISA,TechLabToxA/BQuikChek,TechLabToxinA/BII,ImmunoCardToxinA&B的檢測(cè)效果相對(duì)較好.ImmunoCardToxinA&Btest最大化地縮短了檢測(cè)時(shí)間,整個(gè)過程為16-24分鐘.另外,這種測(cè)驗(yàn)是一個(gè)單項(xiàng)測(cè)驗(yàn)EIA,可能在臨時(shí)檢測(cè)的應(yīng)用上是實(shí)用可行的.其他的快速檢測(cè)方法需要自動(dòng)板閱讀設(shè)備、板清洗機(jī)、離心機(jī)或者一些消耗品(如不包括在檢測(cè)試劑盒在內(nèi)的準(zhǔn)備試劑盒等).大多數(shù)的研究都強(qiáng)調(diào),需要更加縝密的方法如CTA或者厭氧培養(yǎng)等,以確認(rèn)快速檢測(cè)的結(jié)果.另外,快速檢測(cè)可以用來作為鑒定艱難梭菌陽性個(gè)體的初步的篩選方法,可以減少在艱難梭菌感染檢測(cè)的延誤.但是這些快速檢測(cè)普遍存在靈敏度低和陽性預(yù)測(cè)值率等缺點(diǎn)[5].因此,臨床上迫切需要一種快速靈敏的艱難梭菌檢測(cè)方法.
艱難梭菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法
目前的有研究表明,利用分子學(xué)方法進(jìn)行艱難梭菌檢測(cè)更有效[12,13].Peterson等評(píng)價(jià)了real-timePCR檢測(cè)是利用引物以毒素B基因的一段保守區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn).由于所有產(chǎn)毒菌株都攜帶毒素B(有些缺少毒素A),這被視為是產(chǎn)毒菌株的很好的替代標(biāo)記.
這個(gè)研究是分兩個(gè)階段進(jìn)行.第一階段是將送到實(shí)驗(yàn)室的618個(gè)艱難梭菌檢測(cè)標(biāo)本,進(jìn)行普通的EIA測(cè)驗(yàn)與PCR測(cè)驗(yàn)比較.與結(jié)合毒素測(cè)驗(yàn)的厭氧培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)比較,EIA的靈敏度為67%,精確度為92%,而PCR的靈敏度為94%,準(zhǔn)確度為97%.在這個(gè)階段,調(diào)查者還設(shè)定了一套明確艱難梭菌相關(guān)性腹瀉診斷的標(biāo)準(zhǔn),并發(fā)現(xiàn)幾乎所有真正的CDAD病例每天會(huì)有3次或者更多的排便.對(duì)符合該標(biāo)準(zhǔn)的采自病人的370個(gè)標(biāo)本,PCR檢測(cè)的靈敏度比EIA的更高(93%vs.73%).real-timePCR和厭氧培養(yǎng)測(cè)定皆比酶免疫測(cè)定(EIA)更加靈敏(P<.01toP<.05).作者總結(jié),與EIA相比,real-timePCR是一個(gè)更加靈敏,相對(duì)迅速的測(cè)驗(yàn),應(yīng)該在臨床實(shí)踐中考慮替代用來檢測(cè)毒性艱難梭菌的酶免疫測(cè)定.
目前市場(chǎng)上推出的艱難梭菌快速分子檢測(cè)有BDGeneOhmreal-timePCRtest和Cepheid公司的GeneXpertC.difficile快速檢測(cè)方法等.Stamper等(2009)評(píng)價(jià)了BDGeneOhmreal-timePCRtest的檢測(cè)效果,引用的標(biāo)準(zhǔn)是商業(yè)化應(yīng)用的CTA(WampoleC.difficileToxinBtest).通過研究表明,GeneOhm的靈敏度為83.6%(95%CI:74.3%to92.9%),精確度為98.2%(96.8%to99.6%),PPV和NPV分別為89.5%(81.5%to97.4%)、97.1%(95.3%to98.9%).整個(gè)GeneOhmreal-timePCRtest大概需要3h,而一般CTA需要24-48h,厭氧培養(yǎng)的時(shí)間大約為5天.作者總結(jié)認(rèn)為,GeneOhm是一個(gè)快速靈敏的C.difficile分子檢測(cè)方法[14].而Cepheid公司推出的GeneXpertC.difficile快速分子檢測(cè),具有更強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì).整個(gè)檢測(cè)過程僅需要30分鐘.與肉湯富集產(chǎn)毒培養(yǎng)進(jìn)行比較,其靈敏度為93.5%,精確度為94.0%.與現(xiàn)有的PCR檢測(cè)、細(xì)胞毒素測(cè)定、EIA等各種檢測(cè)方法比較,其具有高度的靈敏度.因此,相比之下,GeneXpertC.difficile檢測(cè)是一種更加快速、靈敏的檢測(cè)方法.