酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
酵母菌的形態(tài)觀察及死,活細(xì)胞的鑒別
目的要求
進(jìn)一步學(xué)習(xí)并掌握光學(xué)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用方法；
觀察并掌握酵母菌的個(gè)體形態(tài)及其子囊,子囊孢子和假菌絲的形態(tài)；
學(xué)習(xí)并掌握鑒別酵母菌細(xì)胞死活的方法；
了解酵母菌子囊孢子的染色方法及假菌絲觀察的壓片培養(yǎng)法.
實(shí)驗(yàn)材料
菌種:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),熱帶假絲酵母(Candida tropicalis),粟酒裂殖酵母(Sachizosaccharomyces pombe)
染色液:0.1％美藍(lán)染色液,孔雀綠染色液,沙黃染色液,95％乙醇等
其他:顯微鏡,載玻片,蓋玻片,擦鏡紙,吸水紙等
基本原理
酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物,其大小通常比常見的細(xì)菌大幾倍甚至幾十倍,因此,不必染色即可用顯微鏡觀察其形態(tài).大多數(shù)酵母以出芽方式進(jìn)行無性繁殖,有的二分裂殖；子囊菌綱中的酵母菌在一定條件下,可產(chǎn)生子囊孢子的方式進(jìn)行有性生殖.酵母菌假菌絲的生成與培養(yǎng)基的種類,培養(yǎng)條件等因素有關(guān).
美藍(lán)是一種弱氧化劑,氧化態(tài)呈藍(lán)色,還原態(tài)呈無色.用美藍(lán)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí),活細(xì)胞由于細(xì)胞的新陳代謝作用,細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力,能將美藍(lán)由蘭色的氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色的還原態(tài)型,從而細(xì)胞呈無色；而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則由于細(xì)胞內(nèi)還原力較弱而不具備這種能力,從而細(xì)胞呈藍(lán)色,據(jù)此可對(duì)酵母菌的細(xì)胞死活進(jìn)行鑒別.
操作步驟
水浸片觀察:
制片:在干凈的載玻片中央加一滴預(yù)先稀釋至適宜濃度的酵母液體培養(yǎng)物,從側(cè)面蓋上一片蓋玻片(先將蓋玻片一邊與菌液接觸,然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上),應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,并用吸水紙吸去多余的水分(菌液不宜過多或過少,否則,在蓋蓋玻片時(shí),菌液會(huì)溢出或出現(xiàn)氣泡而影響觀察；蓋玻片不宜平著放下,以免產(chǎn)生氣泡).
鏡檢:將制作好的水浸片置于顯微鏡的載物臺(tái)上,先用低倍鏡,后用高倍鏡進(jìn)行觀察,注意觀察各種酵母的細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式,并進(jìn)行記錄.
美藍(lán)染色
染色:在干凈的載玻片中央加一小滴0.1%美藍(lán)染色液,然后再加一小滴預(yù)先稀釋至適宜濃度的釀酒酵母液體培養(yǎng)物,混勻后從側(cè)面蓋上蓋玻片,并吸去多余的水分和染色液(注意染色液和菌液不宜過多或過少,并應(yīng)基本等量,而且要混勻).
鏡檢:將制好的染色片置于顯微鏡的載物臺(tái)上,放置約3分鐘后進(jìn)行鏡檢,先用低倍鏡,后用高倍鏡進(jìn)行觀察,根據(jù)細(xì)胞顏色區(qū)分死細(xì)胞(藍(lán)色)和活細(xì)胞(無色),并進(jìn)行記錄.
比較:染色約30分鐘后再次進(jìn)行觀察,注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加.
酵母菌死亡率一般用百分?jǐn)?shù)來表示,以下式來計(jì)算:
死亡率=死細(xì)胞總數(shù)÷死活細(xì)胞總數(shù)×100%
酵母菌液泡系的話體觀察
于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液,取少許上述酵母菌懸液與之混合,染色5分鐘,加蓋玻片在顯微鏡下觀察.細(xì)胞無色,液泡呈紅色.
酵母菌細(xì)胞中肝糖粒的觀察
將1滴碘液置于載玻片中央,接人上述酵母菌懸液,混勻,蓋上蓋玻片,顯微鏡觀察,細(xì)胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色.
子囊孢子的染色與觀察
活化酵母:將釀酒酵母移種至新鮮的麥芽汁瓊脂斜面上,培養(yǎng)24h,然后再轉(zhuǎn)種2~3次
生孢培養(yǎng):將經(jīng)活化的菌種轉(zhuǎn)移到醋酸鈉培養(yǎng)基上,28攝氏度培養(yǎng)7~10d.
制片:在潔凈載玻片的中央滴一小滴蒸餾水,用接種環(huán)于無菌條件下挑取少許產(chǎn)孢培養(yǎng)物至水滴上,涂布均勻,自然風(fēng)干后在酒精燈火焰上熱固定(水和菌均不要太多,涂布時(shí)應(yīng)盡量涂開,否則將造成干燥時(shí)間長(zhǎng)；熱固定溫度不宜太高,以免使菌體變形).
染色:滴加數(shù)滴孔雀綠染色液,1分鐘后水洗；加95%乙醇脫色30s,水洗；再用沙黃染色液復(fù)染30s,水洗,最后用吸水紙吸干.
鏡檢:將染色片置于顯微鏡的載物臺(tái)上,先用低倍鏡,后用高倍鏡進(jìn)行觀察,子囊孢子呈綠色,菌體和子囊呈粉紅色.注意觀察子囊孢子的數(shù)目,形狀,并進(jìn)行記錄.
子囊形成率(%)=3個(gè)視野中形成子囊的總數(shù)÷3個(gè)視野中(形成子囊的總數(shù)+不產(chǎn)孢子細(xì)胞總數(shù))×100%
假菌絲的觀察
壓片培養(yǎng)法:取新鮮的酵母菌在薄層馬鈴薯浸出汁瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接種2~3條,取無菌蓋玻片蓋在接種線上,于25~28攝氏度培養(yǎng)4~5天后,打開皿蓋,置于顯微鏡下直接觀察劃線的兩側(cè)所形成的假菌絲的形狀.
另一法:取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中,取出放在溫室培養(yǎng)的支架上,待培養(yǎng)基凝固后,進(jìn)行酵母菌劃線接種,然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上(圖12—1),28攝氏度培養(yǎng)2至3d后,取出載玻片,擦去載玻片下面的培養(yǎng)基,在顯微鏡下直接觀察.可見到芽殖酵母形成的藕節(jié)狀假菌絲,裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲(圖12—2).
自然狀態(tài)下的酵母菌觀察取一滴美藍(lán)染色液于載玻片中央,春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜,冬季取腌酸菜湯上的白膜,將其置于載玻片染色液中,蓋上蓋玻片,顯微鏡下仔細(xì)觀察酵母菌形態(tài),出芽生殖,假菌絲等.
自然狀態(tài)下的酵母菌觀察
取一滴美藍(lán)染色液于載玻片中央,春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜,冬季取腌酸菜湯上的白膜,將其置于載玻片染色液中,蓋上蓋玻片,顯微鏡下仔細(xì)觀察酵母菌形態(tài),出芽生殖,假菌絲等.
注:酵母菌的簡(jiǎn)易培養(yǎng)
配2%葡萄糖水(或自糖水),煮沸,裝入三角瓶中(液面高度2至2cm),加HCl調(diào)至pH3至5放入幾塊葡萄皮(或其他糖分較高的果皮),置5至28攝氏度溫箱中培養(yǎng)2至3d,聞到酒香味后,即可取培養(yǎng)液鏡檢.
日水生物摘自網(wǎng)絡(luò)