微生物培養(yǎng)基制備的注意事項
發(fā)布時間:
2022-12-27
作者:
微生物培養(yǎng)基制備的注意事項
定義
培養(yǎng)基是供給微生物、植物或動物(或組織)生長繁殖的,由不同營養(yǎng)物質組合配制而成的營養(yǎng)基質.
組成
一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)、維生素和水等幾大類物質.培養(yǎng)基既是提供細胞營養(yǎng)和促使細胞增殖的基礎物質,也是細胞生長和繁殖的生存環(huán)境.
分類
培養(yǎng)基種類很多,根據(jù)配制原料的來源可分為自然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基;根據(jù)物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基;根據(jù)培養(yǎng)功能可分為基礎培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等;根據(jù)使用范圍可分為細菌培養(yǎng)基、放線菌培養(yǎng)基、酵母菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基等.
培養(yǎng)基配成后一般需測試并調節(jié)pH,還須進行滅菌,通常有高溫滅菌和過濾滅菌.培養(yǎng)基由于富含營養(yǎng)物質,易被污染或變質.配好后不宜久置,最好現(xiàn)配現(xiàn)用.
以下是一些實驗室在制作培養(yǎng)基時候的經(jīng)驗總結
1、培養(yǎng)基配方選擇
同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別.因此,除所用的是標準方法,應嚴格按其規(guī)定進行配制外,一般均應盡量收集有關資料,加以比較核對,再依據(jù)自己的使用目的,加以選用,記錄其來源.
2、培養(yǎng)基制備記錄
每次制備培養(yǎng)基均應有記錄,包括培養(yǎng)基名稱,配方及其來源,和各種成份的牌號,最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等,記錄應復制一份,原記錄保存?zhèn)洳?復制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂.
3、培養(yǎng)基成份稱量
培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂,最好一次完成,不要中斷.可將配方置于傍側,每稱完一種成分即在配方上做出記號,并將所需稱取的藥品一次取齊,置于左側,每種稱取完畢后,即移放于右側.完全稱取完畢后,還應進行一次檢查.
4、培養(yǎng)基成份的混合與溶化
培養(yǎng)基所用化學藥品均應是化學純的.使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋,以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中,使細菌不易生長.最好使用不銹鋼加熱溶化,可放入大燒杯或大燒瓶中置于高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化.
5、培養(yǎng)基pH值的調正
pH因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化,培養(yǎng)基各成分完全溶解后,應進行pH的初步調正.例如,牛肉浸液約可降低pH0.2,而腸浸液pH卻會有顯著的升高.因此,對這個步驟,操作者應隨時注意探索經(jīng)驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終pH,保證培養(yǎng)基的質量.pH調整后,還應將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘,以利培養(yǎng)基沉淀物的析出.
6、培養(yǎng)基過濾澄清
液體培養(yǎng)基必須絕對澄清,瓊脂培養(yǎng)基也應透明無顯著沉淀,因此,須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求.一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法,濾紙應折疊成折扇或漏斗形,以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂.
瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾.亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾.新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去,再用濾紙反復過濾.如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法.
即將冷卻至55~60攝氏度的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內,裝入量不得超過燒瓶容量的1/2,每1000毫升培養(yǎng)基加入1~2個雞蛋的蛋白,強力振搖3~5分鐘,置于高壓蒸汽滅菌器中、121攝氏度加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可.
7、培養(yǎng)基分裝
培養(yǎng)基的分裝,應按使用的目的和要求,分裝于試管、燒瓶等適當容器內.分裝量不得超過容器裝盛量的2/3.容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵,其外還須用防水紙包扎(現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者).分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器.分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時,分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為恰當.
分裝容器應預先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒,以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌.每批培養(yǎng)基應另外分裝20毫升培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中,隨該批培養(yǎng)基同時滅菌,以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用.
8、培養(yǎng)基滅菌
一般培養(yǎng)基可采用121攝氏度高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法.在各種培養(yǎng)基制備方法中,如無特殊規(guī)定,即可用此法滅菌.
某些畏熱成分,如糖類,應另行配成20%或更高的濃液,以過濾或間歇滅菌法消毒,以后再用無菌操作技術、定量加于培養(yǎng)基.明膠培養(yǎng)基亦應用較低溫度滅菌.血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術抽取和加入于經(jīng)冷卻約50攝氏度左右的培養(yǎng)基中.
瓊脂斜面培養(yǎng)基應在滅菌后立即取出,冷至55-60攝氏度時,擺成適當斜面,待其自然凝固.
9、培養(yǎng)基質量測試
每批培養(yǎng)基制備好以后,應仔細檢查一遍,如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應挑出棄去.并測定其最終pH.將全部培養(yǎng)基放入36±1攝氏度恒溫箱培養(yǎng)過夜,如發(fā)現(xiàn)有菌生長,即棄去.用有關的標準菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基,培養(yǎng)24~48小時,如無菌生長或生長不好.應追查原因并重復接種一次,如結果仍同前,則該批培養(yǎng)基即應棄去,不能使用.
(1)澄清度
水是細胞培養(yǎng)基的溶劑.細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分只有完全溶解于水才能被細胞吸收攝取,細胞才能生長增殖,因此細胞培養(yǎng)基是否溶解以及培養(yǎng)液是否透明澄清直接影響培養(yǎng)基使用.該項目是通過對水溶解后的細胞培養(yǎng)基的澄清度檢查,判斷細胞培養(yǎng)基的澄清度.按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅨB進行.
(2)pH值
哺乳類動物細胞生長需要合適的酸堿度,pH過高或者過低都會導致細胞死亡.pH值的測定也可以檢查細胞培養(yǎng)基的批間差.清大天一標準規(guī)定取規(guī)定量供試品,用注射用水(水溫20攝氏度-30攝氏度)溶解至1L,加入規(guī)定量碳酸氫鈉到上述溶液中,用與細胞培養(yǎng)基溶液pH值相近的兩點標準緩沖液校準后的酸度計進行測定.按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅥH進行;加入規(guī)定量的碳酸氫鈉到上述溶液中,按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅥH進行.
(3)干燥減量的質量分數(shù)
細胞培養(yǎng)基具有吸濕性,在空氣中放置水分會很快升高,干燥減量的質量分數(shù)表示產(chǎn)品中含濕量.細胞培養(yǎng)基是有菌制劑,其豐富的營養(yǎng)成分有利于微生物生長,控制細胞培養(yǎng)基中的水分可以防止微生物的繁殖,保持細胞培養(yǎng)基的養(yǎng)分.按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅧL干燥失重測定法進行.
(4)滲透壓
溶劑通過半透膜由低濃度向高濃度溶液擴散的現(xiàn)象稱為滲透,阻止?jié)B透所需施加的壓力,稱為滲透壓.細胞必須生活在等滲環(huán)境中,動物細胞借助K+、Na+維持滲透平衡.大多數(shù)細胞對滲透壓有一定的耐受性.但是培養(yǎng)液滲透壓過高容易使細胞脫水萎縮,培養(yǎng)液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂,因此要控制培養(yǎng)基的滲透壓范圍.按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅨG滲透壓摩爾濃度測定法進行.
(5)細菌內毒素
細菌內毒素是許多病原性細菌所產(chǎn)生的毒素.它的特殊性在于不是細菌或細菌的代謝產(chǎn)物,而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有生物活性的物質.培養(yǎng)基細菌內毒素過高,對生物制品疫苗(如狂犬、乙肝疫苗)、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細菌內毒素.因此本項目的檢驗符合生物制品質量控制要求.
常規(guī)細胞培養(yǎng)基的細菌內毒素標準定為<10EU/毫升.稱取本品規(guī)定量的1/100,加入細菌內毒素檢查用水10毫升溶解,吸取該溶液0.1毫升加細菌內毒素檢查用水3.9毫升,混勻即得試樣.按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅪE細菌內毒素檢查法中的凝膠法進行.
(6)微生物限度
細胞培養(yǎng)基不是無菌產(chǎn)品,其中的微生物在一定條件下會吸收細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質滋生繁殖,導致細胞培養(yǎng)基變質失效.控制細胞培養(yǎng)基中細菌和霉菌,是延長細胞培養(yǎng)基有效期的方法之一.
參考《中華人民共和國藥典》2005版二部附錄第100頁的口服給藥制劑的微生物限度標準,并嚴于該標準,規(guī)定細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的細菌數(shù)每1g不得超過200個,霉菌數(shù)每1g不得超過50個.稱取樣品1g,加入無菌純化水10毫升溶解,混勻即得試樣.按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法進行,檢查項目為細菌數(shù)、霉菌數(shù).檢查法采用平皿法.
(7)細胞生長試驗
這是一個性能特性表述的要求.細胞培養(yǎng)基的功能就是培養(yǎng)哺乳類動物細胞,因此經(jīng)過細胞培養(yǎng)效果的檢驗是產(chǎn)品質量優(yōu)劣的直觀表述,這也是很多生物制藥用戶要求的一項指標.
目前國內尚無細胞培養(yǎng)和計數(shù)的法定方法,可參考《體外培養(yǎng)的原理與技術》中細胞計數(shù)法論述的內容給出.按產(chǎn)品說明書配制培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng),前四天用含10%小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng),觀察細胞形態(tài)并計數(shù),檢查細胞培養(yǎng)基是否有促生長的能力.后三天用不含小牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng),觀察細胞形態(tài)并計數(shù),檢查細胞培養(yǎng)基中是否有不利細胞生長的毒素.本試驗用細胞為VERO細胞.
10、培養(yǎng)基保存培養(yǎng)基應存放于冷暗處,最好能放于普通冰箱內.放置時間不宜超過一周,傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天.每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標簽.