微生物鑒定之生化實驗大全
發(fā)布時間：
2022-12-27
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微生物鑒定之生化實驗大全
一、各種酶類實驗
過氧化氫酶試驗(觸酶試驗)
(1)原理:具有過氧化氫酶的細菌,能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧,繼而形成氧分子,出現(xiàn)氣泡.(2)實驗方法:取潔凈玻片1張,用接種環(huán)挑取細菌,加3%過氧化氫數(shù)滴,立即觀察結果.(3)結果:若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性.無氣泡為陰性.(4)應用:革蘭陽性球菌中,葡萄球菌和微球菌均產生過氧化氫酶,但鏈球菌科陰性,故該試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群.
硝酸鹽還原實驗
(1)原理:硝酸鹽還原反應包括兩個過程:一是在合成代謝過程中,硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨,再由氨轉化為氨基酸和細胞內其它含氮化合物;二是在分解代謝過程中,硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體.硝酸鹽還原過程可因細菌不同而異.有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,如大腸埃希菌等;有的細菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨;有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮,如假單胞菌;有的細菌還可以將其還原產物在合成性代謝中完全利用.(2)實驗方法:將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基(內含小倒管)中,35孵育1至4d.將甲、乙等量混合液(用時混合)(約0.1毫升)加于試管內,立即觀察結果.(3)結果:出現(xiàn)紅色為陽性反應.若加入試劑后無顏色反應,可能是:
硝酸鹽沒有被還原,試驗陰性;硝酸鹽被還原為氨和氮等其他物質而導致假陰性結果,這時應在試管內加入少許鋅粉,如出現(xiàn)紅色則表明試驗確實為陰性.若仍不產生紅色,表明試驗為假陰性.
若要觀察是否有氮氣產生,可于培養(yǎng)基管內加1只小導管,有氣泡產生,則表示有氮氣生成.(4)應用:本試驗廣泛用于細菌鑒定.腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌屬均可產生氮氣;有些厭氧菌如韋榮菌等試驗也為陽性.
淀粉酶實驗
(1)原理:有些細菌具有合成淀粉酶的能力,可以分泌胞外淀粉酶,淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖,淀粉水解后遇碘不在變藍.(2)培養(yǎng)基:淀粉瓊脂培養(yǎng)基.(3)實驗方法:在淀粉培養(yǎng)基上接種實驗菌株后,30培養(yǎng)1～2周后將平板取出,滴加少量盧戈氏碘液于平板上.觀察菌苔周圍的培養(yǎng)基有無色透明圈出現(xiàn).
氧化酶試驗
(1)原理:氧化酶(即細胞色素氧化酶),是細胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶.具有氧化酶的細菌,首先使細胞色素C氧化,再由氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化,生成有色的醌類化合物.因此,本試驗結果與細胞色素C的存在有關.(2)實驗方法:菌落法:直接滴加試劑于被檢菌落上;濾紙法:取潔凈濾紙一小塊,蘸取菌少許,然后加試劑;試劑紙片法:將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片,取菌涂于試劑紙上.(3)結果:細菌在與試劑接觸10秒內呈深紫色,為陽性.無色為陰性.為保證結果的準確性,分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照.(4)應用:主要用于腸桿菌科細菌和假單胞菌屬的鑒別,前者陰性,而后者陽性.奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應.
二、碳水化合物代謝實驗
糖(醇、苷)類發(fā)酵實驗
(1)原理:細菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關,故分解糖的能力各不相同,細菌分解糖類后的終產物亦不一致,在含糖培養(yǎng)基中加入指示劑,若細菌分解糖則產酸或產酸產氣,使培養(yǎng)基顏色改變,從而判斷細菌是否分解某種糖或其他碳水化合物(2)基本培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入0.5%～1%的糖類(單糖、雙糖、或者多糖)、醇類(甘露醇、肌醇)苷類(水楊苷、菊糖等).培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型.(3)實驗方法:取某一種細菌的24h純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養(yǎng)基內,37培養(yǎng)24h,觀察結果并記錄.(4)結果判定:如果接種進去的細菌可發(fā)酵某種糖或醇,則可產酸,使培養(yǎng)基由紫色變成黃色,如果不發(fā)酵,則仍保持紫色.如,發(fā)酵的同時又產生氣體,則在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡.(5)應用:是鑒定細菌最主要最基本的實驗,特別是對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要.
氧化型與發(fā)酵型(O/F)的測定
(1)原理:細菌在分解葡萄糖的過程中,必需有氧的參加的,稱為氧化型,細菌在分解葡萄糖的過程中,可以進行無氧降解的,稱為發(fā)酵型.發(fā)酵型細菌無論在有氧或者無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖.不分解葡萄糖的細菌稱為產堿型.這在區(qū)別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義.(2)培養(yǎng)基:培養(yǎng)基蛋白胨2g,氯化鈉5g,磷酸氫二鉀0.3g,葡萄糖10g,瓊脂3g,1％溴麝香草酚藍3毫升,蒸餾水1000毫升.將蛋白胨、鹽、瓊脂和水混合,加熱溶解,校正pH至7.2,然后加葡萄糖和指示劑,加熱溶解;分裝試管,3～4毫升/管;115,高壓蒸汽滅菌20min,取出后冷卻成瓊脂柱.(3)實驗方法:挑取18～24h的幼齡斜面培養(yǎng)物,穿刺接種,每種細菌接種兩管,于其中1管覆蓋1毫升滅菌的液體石蠟,37培養(yǎng)24小時或更長時間.(4)結果判定.
Β-半乳糖苷(ONPG)實驗
(1)原理:有的細菌可以產生β一半乳糖苷酶,能分解鄰－硝基酚－β－D－半乳糖苷,而生成黃色的鄰－硝基酚,在很低濃度下也可以檢測出.(2)培養(yǎng)基:鄰硝基酚β-半乳糖苷0.6g,0.01mol／LpH7.5磷酸緩沖液1000毫升,pH7.5的滅菌1%蛋白胨水300毫升.先將前兩種成分混合溶解,過濾除菌,在無菌條件下與1％蛋白胨水混合,分裝試管,每管2～3毫升,無菌檢驗后備用.(3)實驗方法:取一環(huán)細菌純培養(yǎng)物接種在ONPG培養(yǎng)基上置37培養(yǎng)1～3h或24h,如有β－半乳糖苷酶,會在3h內產生黃色的鄰硝基酚;如無此酶,則在24h內不變色.
七葉苷水解實驗
(1)原理:有的細菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖,七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應,生成黑色的化合物,使培養(yǎng)基呈黑色.(2)應用:主要用于腸球菌與其它鏈球菌的鑒別,前者陽性,后者陰性,也可用于革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別.
甲基紅實驗
(1)原理:細菌分解培養(yǎng)基中的葡萄糖產酸,當產酸量大,使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下時,加入甲基紅指示劑而變紅,為甲基紅試驗陽性.若細菌分解葡萄糖產酸量少,或產生的酸進一步轉化為其它物質(如,醇、酮、醛、氣體和水等)則培養(yǎng)基的pH值仍在pH6.2以上,故加入甲基紅試劑呈黃色,為陰性.
(2)實驗方法:一種細菌的24h培養(yǎng)物,接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,置37培養(yǎng)48～72h,取出后加甲基紅試劑3～5滴,凡培養(yǎng)液呈紅色者為陽性,橙色者為可疑,黃色者為陰性.
(3)應用:主要用于鑒別大腸埃希菌與產氣腸桿菌,前者為陽性后者為陰性.
V-P實驗
(1)原理:有些細菌能分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸脫羧產生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中,被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與培養(yǎng)基內蛋白胨中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應生成紅色的化合物.若培養(yǎng)基中的胍基含量過少,則可加入少量含胍基的化合物等.(2)V-P試劑:肌酸0.3%或原粉,40%的NaOH溶液.(3)實驗方法:接種實驗菌于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(與甲基紅實驗相同)中,每次兩個重復,置適溫培養(yǎng)2-6d,取培養(yǎng)液和40%NaOH等量相混,加入少許肌酸,10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色,即為實驗陽性反應,有時需要放置更長時間才出現(xiàn)紅色反應.(4)應用:本實驗常與甲基紅實驗一起用,因為前者陽性的細菌,后者通常為陰性.
三、蛋白質和氨基酸的代謝實驗
硫化氫試驗
(1)原理:某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸產生硫化氫,硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結合形成黑色沉淀物(硫化鐵或硫化鉛沉淀).(2)實驗方法:將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中,于35孵育24h-48h,觀察有無黑色沉淀出現(xiàn).(3)結果:培養(yǎng)基變黑為陽性,不變?yōu)殛幮?(4)應用:主要用于鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別,如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性,其它菌屬大多為陰性.但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株,如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等.
尿素分解試驗
(1)原理:某些細菌具有尿素分解酶,能分解尿素產生大量的氨,使培養(yǎng)基呈堿性.(2)培養(yǎng)基:尿素培養(yǎng)基.(3)實驗方法:將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基,于35孵育18至24h小時觀察結果.(4)結果:培養(yǎng)基呈堿性,使酚紅指示劑變紅為陽性,不變?yōu)殛幮?(5)應用:主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定.奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性,另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性,而斯氏和產堿普羅威登菌陰性.
苯丙氨酸脫氨酶試驗
(1)原理:測定細菌是否產生苯丙氨酸脫氨酶.細菌產生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸,加入氯化鐵試劑后產生綠色反應.(2)培養(yǎng)基:苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基.(3)實驗方法:將待檢菌大量接種入苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基中,35孵育18至24h,滴加10%三氯化鐵試劑3至4滴,自斜面上方流下.(4)結果:有綠色出現(xiàn)為陽性.應立即觀察結果,延長反應時間會引起退色.(5)應用:主要用于腸桿菌科細菌的鑒定.變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性,腸桿菌科其它細菌均為陰性.
氨基酸脫羧酶試驗
(1)原理:某些細菌可產生氨基酸脫羧酶,能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳.由于胺的生成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,可用指示劑指示出來.(2)培養(yǎng)基:氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基.(3)實驗方法:將待檢菌分別接種于1支氨基酸(賴氨酸,鳥氨酸或精氨酸)脫羧酶試驗管1支氨基酸脫羧酶對照管(無氨基酸),各覆蓋至少12.5px高度的無菌石蠟油,35孵育1至4d,每日觀察結果.(4)結果:對照管應為黃色,若為溴甲酚紫指示劑,則測定管呈紫色則為陽性,若測定管呈黃色為陰性.若對照管呈現(xiàn)紫色則試驗無意義,不能做出判斷.(5)應用:主要用于腸桿菌科細菌的鑒別.如,沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外,其余沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性.志賀菌屬除宋內和鮑氏志賀菌外,其他志賀菌均為陰性.
明膠液化實驗
(1)原理:某些可以產生一種胞外蛋白水解酶(明膠酶),能使明膠分解為氨基酸,使明膠失去凝固能力而液化,因而使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體.(2)實驗方法:取18～24h的斜面培養(yǎng)物穿刺接種,并有兩支未接種的空白對照.(3)結果觀察:于30培養(yǎng)20天后觀察,明膠液化的為陽性.由于室溫下明膠培養(yǎng)基呈液狀,因此在觀察結果時,應將其放置于4的冰箱中30分鐘后拿出觀察.若明膠仍能全部凝固,為陰性,有部分或全部不能凝固為陽性.
吲哚實驗(1)原理:某些細菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨水中的色氨酸產生吲哚,當加入吲哚試劑(對二甲氨基苯甲醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚.(2)培養(yǎng)基:蛋白胨水培養(yǎng)基.(3)實驗方法:將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中,35孵育24至48h,沿試管壁慢慢加入吲哚試劑,觀察結果.(4)結果:于兩液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性,無色為陰性.(5)應用:主要用于腸桿菌科細菌的鑒定,如大腸埃希菌與產氣腸桿菌,肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌等的鑒別.