微生物細(xì)菌培養(yǎng)基的制備過程中需要注意的步驟
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
微生物細(xì)菌培養(yǎng)基的制備過程中需要注意的步驟
在制備培養(yǎng)基的過程中,首先要使用一些玻璃器皿,如試管,三角瓶,培養(yǎng)皿,燒杯和吸管等.這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況,經(jīng)過一定的處理,洗刷干凈.有的還要進(jìn)行包裝,經(jīng)過滅菌等準(zhǔn)備就緒后,才能使用.
新購(gòu)的玻璃器皿
除去包裝沾染的污垢后,先用熱肥皂水刷洗,流水沖凈,再浸泡于１至２％的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí),使游離的堿性物質(zhì)除去,再以流水沖凈.對(duì)容量較大的器皿,如大燒瓶,量筒等,洗凈后注入濃鹽酸少許,轉(zhuǎn)動(dòng)容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸,數(shù)分鐘后傾去鹽酸,再以流水沖凈,倒置于洗滌架上將水空干,即可使用.
用過的玻璃器皿peiyangji制備技術(shù)玻璃皿圖
凡確無病原菌或未被帶菌物污染的器皿,使用后可隨時(shí)沖洗,吸取過化學(xué)試劑的吸管,可先浸泡于清水中,待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清洗.有可能被病原菌污染的器皿,必須經(jīng)過適當(dāng)消毒后,將污垢除去,用皂液洗刷,再用流水沖洗干凈.若用皂液未能洗凈的器皿,可用洗液浸泡適當(dāng)時(shí)間后再用清水洗凈.洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸,其作用是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì),以便沖洗.洗液有很強(qiáng)的腐蝕作用,使用時(shí)應(yīng)特別小心,避免濺到衣服,身體和其他物品上.
類型
在實(shí)驗(yàn)室中配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營(yíng)養(yǎng)基質(zhì),都叫做培養(yǎng)基 Media .由于各類微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不同,培養(yǎng)目的和檢測(cè)需要不同,因而培養(yǎng)基的種類很多.我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn),劃分為若干類型.
根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分,可分為天然合成和半合成培養(yǎng)基.
天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng),植物或微生物的原料,其成分難以確切知道.主要原料有：牛肉膏,麥芽汁,蛋白胨,酵母膏,玉米粉,麩皮,各種餅粉,馬鈴薯,牛奶,血清等.用這些物質(zhì)配成雖然不能確切知道它的化學(xué)成分,但一般來講,營(yíng)養(yǎng)是比較豐富的,微生物生長(zhǎng)旺盛,而且來源廣泛,配制方便,所以較為常用,尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基.穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號(hào)等因素的影響.
合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基,它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成.這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確,重復(fù)性強(qiáng),但價(jià)格昂貴,而微生物又生長(zhǎng)緩慢,所以它只適用于做一些科學(xué)研究,例如營(yíng)養(yǎng),代謝的研究.
在合成培養(yǎng)基中,加入某種或幾種天然成分;或者在天然培養(yǎng)基中,加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基.例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等.這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多.
根據(jù)物理狀態(tài)來區(qū)分,可以分為固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基.
液體培養(yǎng)基所配制的是液態(tài)的,其中的成分基本上溶于水,沒有明顯的固形物,液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻,易于控制微生物的生長(zhǎng)代謝狀態(tài).
在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基.常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂,明膠,硅膠等,以瓊脂最為常用,在實(shí)際中用得十分廣泛.在實(shí)驗(yàn)室中,它被用作微生物的分離,鑒定,檢驗(yàn)雜菌,計(jì)數(shù),保藏,生物測(cè)定等.
如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中,就制成了半固體.以瓊脂為例,它的用量在0.2至1%之間.這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來觀察微生物的動(dòng)力,有時(shí)用來保藏菌種.
根據(jù)用途來區(qū)分,可分為選擇,增殖和鑒別培養(yǎng)基.
在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長(zhǎng)的稱之為選擇培養(yǎng)基.如鏈霉素,氯霉素等抑制原核微生物的生長(zhǎng);而制霉菌素,灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長(zhǎng);結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)等.
在自然界中,不同種的微生物常生活在一起,為了分離我們所需要的微生物,在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),以增加這種微生物的繁殖速度,逐漸淘汰其它微生物,稱為增殖培養(yǎng)基,常用于菌種篩選和選擇增菌中.在某種程度上講,增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基.
在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品,使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別,因而有助開快速鑒別某種微生物,稱之為鑒別培養(yǎng)基.例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍(lán)就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基.
有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用.例如食品檢驗(yàn)中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例.它含有膽鹽,乳糖和中性紅.膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用 選擇性 ,乳糖和中性紅 指示劑 能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌 如大腸桿菌 和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌 如沙門氏菌和志賀氏菌 .
另外,根據(jù)營(yíng)養(yǎng)成分是否“完全”,可以分為基本,完全和補(bǔ)充培養(yǎng)基,這類術(shù)語(yǔ)主要是用在微生物遺傳學(xué)中.根據(jù)生產(chǎn)的目的來區(qū)分,可以分為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基.還有專門用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基,如雞胚等;專門用于培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基等.
制備的基本方法和注意事項(xiàng)
配方的選定
同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會(huì)有某些差別.因此,除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法,應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外,一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料,加以比較核對(duì),再依據(jù)自己的使用目的,加以選用,記錄其來源.
制備記錄
每次制備均應(yīng)有記錄,包括名稱,配方及其來源,和各種成份的牌號(hào),最終pH值,消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等,記錄應(yīng)復(fù)制一份,原記錄保存?zhèn)洳?復(fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放,以防發(fā)生混亂.
成分的稱取
培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂,最好一次完成,不要中斷.可將配方置于傍側(cè),每稱完一種成分即在配方面軍做出記號(hào),并將所需稱取的藥品一次取齊,置于左側(cè),每種稱取完畢后,即移放于右側(cè).完全稱取完畢后,還應(yīng)進(jìn)行一次檢查.
各成份的混合和溶化
培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的.使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋,以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中,使細(xì)菌不易生長(zhǎng).最好使用不銹鋼鍋加熱溶化,可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化.在鍋中溶化時(shí),可先用溫水加熱并隨時(shí)擾動(dòng),以防焦化,如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象,該培養(yǎng)基即不能使用,應(yīng)重新制備.待大部分固體成分溶化后,再用較小火力使所有成分完全溶化,直至煮沸.如為瓊脂溶化,用另一部分水溶化其它成分,然后將兩溶液充分混合.在加熱溶化過程中,因蒸發(fā)而丟失的水分,最后必須加以補(bǔ)足.
pH的初步調(diào)正
因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中,pH會(huì)有所變化,各成分完全溶解后,應(yīng)進(jìn)行pH的初步調(diào)正.例如,牛肉浸液約可降低pH0.2,而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高.因此,對(duì)這個(gè)步驟,操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn),以期能掌握最終pH,保證培養(yǎng)基的質(zhì)量.pH調(diào)整后,還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘,以利培養(yǎng)基沉淀物的析出.
過濾澄清
液體培養(yǎng)基必須絕對(duì)澄清,瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀,因此,須要采用過濾或其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求.一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法,濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形,以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂.
瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾.亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾.新制肉,肝,血和土豆等浸液時(shí),則須先用絨布將碎渣濾去,再用濾紙反復(fù)過濾.如過濾法不能達(dá)到澄清要求,則須用蛋清澄清法.即將冷卻至55至60攝氏度的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶?jī)?nèi),裝入量不得超過燒瓶容量的1/2,每1000ml培養(yǎng)基加入1至2個(gè)雞蛋的蛋白,強(qiáng)力振搖3至5分鐘,置高壓蒸汽滅菌器中,121攝氏度加熱20分鐘,取出趁熱以絨布過濾即可.
分裝
應(yīng)按使用的目的和要求,分裝于試管,燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi).分裝量不得超過容器裝盛量的2/3.容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵,其外還須用防水紙包扎 現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者 .分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器.分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí),分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng).分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒,以利于徹底滅菌.每批應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中,隨該批同時(shí)滅菌,以為測(cè)定該批培養(yǎng)基最終pH之用.
滅菌
一般培養(yǎng)基可采用121攝氏度高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法.在各種培養(yǎng)基制備方法中,如無特殊規(guī)定,即可用此法滅菌.
某些畏熱成分,如糖類,應(yīng)另行配成20%或更高的濃液,以過濾或間歇滅菌法消毒,以后再用無菌操作技術(shù),定量加于培養(yǎng)基.明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌.血液,體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50攝氏度左右的培養(yǎng)基中.
瓊脂斜面應(yīng)在滅菌后立即取出,冷至55-60時(shí),擺置成適當(dāng)斜面,待其自然凝固.
質(zhì)量測(cè)試
制備好以后,應(yīng)仔細(xì)檢查一遍,如發(fā)現(xiàn)破裂,水分浸入,色澤異常,棉塞被培養(yǎng)基沾染等,均應(yīng)挑出棄去.并測(cè)定其最終pH.
將全部培養(yǎng)基放入36±1攝氏度恒溫箱培養(yǎng)過夜,如發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng),即棄去.
用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1至2管或瓶培養(yǎng)基,培養(yǎng)24至48小時(shí),如無菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不好.應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次,如結(jié)果仍同前,則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去,不能使用.
保存
應(yīng)存放于冷暗處,最好能放于普通冰箱內(nèi).放置時(shí)間不宜超過一周,傾注的平板不宜超過3天.每批產(chǎn)品均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁(yè)或明顯標(biāo)簽.