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2010藥典微生物限度檢查法

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2022-12-27

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微生物實(shí)驗(yàn)室所需試劑耗材培養(yǎng)基

2010藥典微生物限度檢查法

微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料,輔料受微生物污染程度的方法.檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù),霉菌數(shù),酵母菌數(shù)及控制菌檢查.

微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行.檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防止再污染.單向流空氣區(qū)域,工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子,浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證.

供試品檢查時(shí),如果使用了表面活性劑,中和劑或滅活劑,應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物無毒性.

除另有規(guī)定外,本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30攝氏度至35攝氏度；霉菌,酵母菌培養(yǎng)溫度為23攝氏度至28攝氏度.

檢驗(yàn)結(jié)果以1g,1毫升,10g,10毫升,10cm2為單位報(bào)告,特殊品種可以小包裝單位報(bào)告.

檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量(g,毫升或cm2).

除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10毫升；膜劑為100cm2；貴重藥品,微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減.要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20毫升(其中10g用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)).

檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2個(gè)以上?小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少于4片.

一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量(兩個(gè)以上小包裝單位)的3倍量供試品.

供試液的制備

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液.供試液制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過45攝氏度.供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基,不得超過1小時(shí).

除另有規(guī)定外,常用的供試液制備方法如下.

1.液體供試品

取供試品10毫升,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100毫升,混勻,作為1∶10的供試液.油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻.水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液.

2.固體,半固體或黏稠性供試品

取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100毫升,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為1∶10的供試液.必要時(shí)加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻.

3.需用特殊供試液制備方法的供試品

(1)非水溶性供試品

方法1取供試品5g(或5毫升),加至含溶化的(溫度不超過45攝氏度)5g司盤80,3g單硬脂酸甘油酯,10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后,慢慢加入45攝氏度的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100毫升,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1∶20的供試液.

方法2取供試品10g,加至含20毫升無菌十四烷酸異丙酯(制法見附錄ⅩⅢB無菌檢查法中供試品的無菌檢查項(xiàng)下)和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解.然后加入45攝氏度的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100毫升,振搖5至10分鐘,萃取,靜置使油水明顯分層,取其水層作為1∶10的供試液.

(2)膜劑供試品

取供試品100cm2,剪碎,加100毫升的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(必要時(shí)可增加稀釋液),浸泡,振搖,作為1∶10的供試液.

(3)腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品

取供試品10g,加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑)至100毫升,置45攝氏度水浴中,振搖,使溶解,作為1∶10的供試液.

(4)氣霧劑,噴霧劑供試品

取規(guī)定量供試品,置冰凍室冷凍約1小時(shí),取出,迅速消毒供試品開啟部位,用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔,放至室溫,并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器,使拋射劑緩緩全部釋出.用無菌注射器吸出全部藥液,加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(若含非水溶性成分,加適量的無菌聚山梨酯80)中,混勻,取相當(dāng)于10g或10毫升的供試品,再稀釋成1∶10的供試液.

(5)貼劑供試品

取規(guī)定量供試品,去掉貼劑的保護(hù)層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上.用適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布)覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起.然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀釋劑中,用力振蕩至少30分鐘,制成供試液.貼劑也可以其他適宜的方法制備成供試液.

(6)具抑菌活性的供試品

當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí),采用下列方法進(jìn)行處理,以消除供試液的抑菌活性后,再依法檢查.常用的方法如下.

①培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量的供試液,至較大量的培養(yǎng)基中,使單位體積內(nèi)的供試品含量減少,至不含抑菌作用.測(cè)定細(xì)菌,霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí),取同稀釋級(jí)的供試液2毫升,每1毫升供試液可等量分注多個(gè)平皿,傾注瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固,培養(yǎng),計(jì)數(shù).每1毫升供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1毫升的菌落數(shù),計(jì)算每1毫升供試液的平均菌落數(shù),按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí),可加大增菌培養(yǎng)基的用量.

②離心沉淀法取一定量的供試液,500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘,取全部上清液混合,用于細(xì)菌檢查.

③薄膜過濾法見細(xì)菌,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的“薄膜過濾法”.

④中和法凡含汞,砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品,可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分.中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中.

細(xì)菌,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查

細(xì)菌,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查,成品培養(yǎng)基,由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查.

菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代).試驗(yàn)用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存,以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性.

大腸埃希菌(Escherichiacoli)〔CMCC(B)44102〕

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〔CMCC(B)26003〕

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)〔CMCC(B)63501〕

白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC(F)98001〕

黑曲霉(Aspergillusniger)〔CMCC(F)98003〕

菌液制備接種大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌,枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18至24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24至48小時(shí).上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為50至100cfu的菌懸液.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5至7天,加入3至5毫升含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫.然后,用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含孢子數(shù)50至100cfu的孢子懸液.菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用,若保存在2至8攝氏度可在24小時(shí)內(nèi)使用.黑曲霉孢子懸液可保存在2至8攝氏度,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用.

適用性檢查取大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌,枯草芽孢桿菌各50至100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,混勻,凝固,置30至35攝氏度培養(yǎng)48小時(shí),計(jì)數(shù)；取白色念珠菌,黑曲霉各50至100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,混勻,凝固,置23至28攝氏度培養(yǎng)72小時(shí),計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50至100cfu,注入無菌平皿中,立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,平行制備2個(gè)平皿,混勻,凝固,置23至28攝氏度培養(yǎng)72小時(shí),計(jì)數(shù).同時(shí),用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn).

結(jié)果判定被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值大于70%,且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致.判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定.

計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí),應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證,以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌,霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定.若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí),計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證.

驗(yàn)證時(shí),按供試液的制備和細(xì)菌,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行.對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證.

菌種及菌液制備同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查

驗(yàn)證方法驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn),并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率.

(1)試驗(yàn)組平皿法計(jì)數(shù)時(shí),取試驗(yàn)可能用的低稀釋級(jí)供試液1毫升和50至100cfu試驗(yàn)菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,按平皿法測(cè)定其菌數(shù).薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí),取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的低稀釋級(jí)供試液,過濾,沖洗,在后一次的沖洗液中加入50至100cfu試驗(yàn)菌,過濾,按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù).

(2)菌液組測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù).

(3)供試品對(duì)照組取規(guī)定量供試液,按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù).

(4)稀釋劑對(duì)照組若供試液制備需要分散,乳化,中和,離心或薄膜過濾等特殊處理時(shí),應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組,以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度.試驗(yàn)時(shí),可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品,加入試驗(yàn)菌,使菌濃度為每1毫升供試液含50至100cfu,按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù).

結(jié)果判斷在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中,稀釋劑對(duì)照組的菌回收率(稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)應(yīng)均不低于70%.若試驗(yàn)組的菌回收率(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)均不低于70%,照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌,霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%,應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法,離心沉淀法,薄膜過濾法,中和法(表1)等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證.

若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用,那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的,同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染.但是,供試品也可能僅對(duì)試驗(yàn)用菌株具有抑制作用,而對(duì)其他菌株沒有抑制作用.因此,根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則,在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下,應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn).若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求,應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn).

計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí),采用上述方法若還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求,那么選擇回收情況接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢驗(yàn).

驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的細(xì)菌,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行.

供試品檢查

計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法.檢查時(shí),按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌,霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定.

按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備.用稀釋液稀釋成1∶10,1∶102,1∶103等稀釋級(jí)的供試液.

1.平皿法

取供試液1毫升,置直徑90mm的無菌平皿中,注入15至20毫升溫度不超過45攝氏度的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固,倒置培養(yǎng).每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板.

陰性對(duì)照試驗(yàn)取試驗(yàn)用的稀釋液1毫升,置無菌平皿中,注入培養(yǎng)基,凝固,倒置培養(yǎng).每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板,均不得有菌生長(zhǎng).

培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外,細(xì)菌培養(yǎng)3天,霉菌,酵母菌培養(yǎng)5天.逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況；點(diǎn)計(jì)菌落數(shù).必要時(shí),可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告.菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù).點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后,計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù),按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù).若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上.

一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù).在特殊情況下,若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌,則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌,細(xì)菌菌落數(shù).然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù),與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較,以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果.

含蜂蜜,王漿的液體制劑,用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌數(shù),用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定酵母菌數(shù),合并計(jì)數(shù).

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌,酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu,霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級(jí),作為菌數(shù)報(bào)告(取兩位有效數(shù)字)的依據(jù).以?高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g,1毫升或10cm2供試品中所含的菌數(shù).

如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng),或僅低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng),但平均菌落數(shù)小于1時(shí),以＜1乘以低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù).

2.薄膜過濾法

采用薄膜過濾法,濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm,直徑一般為50mm,若采用其它直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整.選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留.濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌.使用時(shí),應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性.水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜.油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥.為發(fā)揮濾膜的大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面.供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量不超過100毫升,總沖洗量不得超過1000毫升,以避免濾膜上的微生物受損傷.

取相當(dāng)于每張濾膜含1g,1毫升或10cm2供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾；若供試品每1g,1毫升或10cm2所含的菌數(shù)較多時(shí),可取適宜稀釋級(jí)的供試液1毫升進(jìn)行試驗(yàn).用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”.沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng).每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜.

陰性對(duì)照試驗(yàn)取試驗(yàn)用的稀釋液1毫升照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對(duì)照.陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng).

培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100個(gè).

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于1g,1毫升或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長(zhǎng),以<1報(bào)告菌數(shù)(每張濾膜過濾1g,1毫升或10cm2供試品),或＜1乘以低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù).

控制菌檢查

控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查

控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查,成品培養(yǎng)基,由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查.檢查項(xiàng)目包括培養(yǎng)基的促生長(zhǎng),指示和抑制特性能力.

菌種對(duì)試驗(yàn)菌種的要求同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查.

大腸埃希菌(Escherichiacoli)〔CMCC(B)44102〕

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〔CMCC(B)26003〕

乙型副傷寒沙門菌(SalmonellaparatyphiB)〔CMCC(B)50094〕

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)10104〕

生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)〔CMCC(B)64941〕

白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC(F)98001〕

菌液制備接種大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌,乙型副傷寒沙門菌,銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18至24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24至48小時(shí).用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1毫升含菌數(shù)為10至100cfu的菌懸液.

菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用,若保存在2至8攝氏度可在24小時(shí)內(nèi)使用.

適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查所用的菌株及檢測(cè)項(xiàng)目見表2.

增菌培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查：分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌(見表2)于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及?短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng).與對(duì)照培養(yǎng)基管比較,被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好.

固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查：取試驗(yàn)菌各0.1毫升(含菌數(shù)50至100cfu)分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng).被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落大小形態(tài)特征應(yīng)一致.

培養(yǎng)基抑制能力檢查：接種不少于100cfu的試驗(yàn)菌(見表2)于被檢培養(yǎng)基中,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及長(zhǎng)時(shí)間下培養(yǎng),試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng).

固體培養(yǎng)基指示能力檢查：取試驗(yàn)菌各0.1毫升(含菌數(shù)不大于100cfu)(見表2)分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時(shí)間下培養(yǎng).被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落形態(tài),大小,指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致.

液體培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌(見表2)于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中,在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng).與對(duì)照培養(yǎng)基管比較,被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況,指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致.

控制菌檢查方法的驗(yàn)證

當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí),應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證,以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查.若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí),檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證.

驗(yàn)證時(shí),依各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株,驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí),應(yīng)采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株.驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行.

菌種及菌液制備同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查驗(yàn)證方法

取規(guī)定量供試液及10至100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)控制菌檢

查法進(jìn)行檢查.當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí),取規(guī)定量供試液,過濾,沖洗,試驗(yàn)菌應(yīng)加在后一次沖洗液中,過濾后,注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中.

結(jié)果判斷若上述試驗(yàn)檢出試驗(yàn)菌,按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌,應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法,離心沉淀集菌法,薄膜過濾法,中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證.

驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行.

供試品檢查

供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行,增菌培養(yǎng)基的實(shí)際用量同控制菌檢查方法的驗(yàn)證.

陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí),應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn).陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10至100cfu,方法同供試品的控制菌檢查.陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌.

陰性對(duì)照試驗(yàn)取稀釋液10毫升照相應(yīng)控制菌檢查法檢查,作為陰性對(duì)照.陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng).

(1)大腸埃希菌(Escherichiacoli)取取供試液10毫升(相當(dāng)于供試品1g,1毫升,10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100毫升)的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18至24小時(shí),必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí).

取上述培養(yǎng)物0.2毫升,接種至含5毫升MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi),培養(yǎng),于5小時(shí),24小時(shí)在366nm紫外線下觀察,同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照.若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光,為MUG陽(yáng)性；不呈現(xiàn)熒光,為MUG陰性.觀察后,沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色,為靛基質(zhì)陰性.本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性.

如MUG陽(yáng)性,靛基質(zhì)陽(yáng)性,判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性,靛基質(zhì)陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽(yáng)性,靛基質(zhì)陰性,或MUG陰性,靛基質(zhì)陽(yáng)性,則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18至24小時(shí).

若平板上無菌落生長(zhǎng),或生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌.若平板上生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)進(jìn)行分離,純化,染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn),確認(rèn)是否為大腸埃希菌.

(2)大腸菌群(Coliform)取含適量(不少于10毫升)的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支,分別加入1∶10的供試液1毫升(含供試品0.1g或0.1毫升),1∶100的供試液1毫升(含供試品0.01g或0.01毫升),1∶1000的供試液1毫升(含供試品,另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1毫升作為陰性對(duì)照管.培養(yǎng)18至24小時(shí).

乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長(zhǎng),或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣,判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣,應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18至24小時(shí).

若平板上無菌落生長(zhǎng),或生長(zhǎng)的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無芽孢桿菌,判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,且為革蘭陰性無芽孢桿菌,應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn).

確證試驗(yàn)從上述分離平板上挑選4至5個(gè)疑似菌落,分別接種于乳糖發(fā)酵管中,培養(yǎng)24至48小時(shí).若產(chǎn)酸產(chǎn)氣,判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群,否則判未檢出大腸菌群.

根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù),按表5報(bào)告1g或1毫升供試品中的大腸菌群數(shù).表5可能的大腸菌群數(shù)表各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群

(3)沙門菌(Salmonella)取供試品10g或10毫升,直接或處理后接種至適量(不少于200毫升)的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,用勻漿儀或其他適宜方法混勻,培養(yǎng)18至24小時(shí).

取上述培養(yǎng)物1毫升,接種于10毫升四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18至24小時(shí)后,分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂(或沙門,志賀菌屬瓊脂)培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂)培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18至24小時(shí)(必要時(shí)延長(zhǎng)至40至48小時(shí)).若平板上無菌落生長(zhǎng),或生長(zhǎng)的菌落不同于表6所列的特征,判供試品未檢出沙門菌.

若平板上生長(zhǎng)的菌落與表6所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,用接種針挑選2至3個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種,培養(yǎng)18至24小時(shí),如斜面未見紅色,底層未見黃色；或斜面黃色,底層無黑色,判供試品未檢出沙門菌.否則,應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),確認(rèn)是否為沙門菌.

(4)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)取供試液10毫升(相當(dāng)于供試品1g,1毫升,10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100毫升)的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18至24小時(shí).取上述培養(yǎng)物,劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18至24小時(shí).

銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平,無定形,周邊擴(kuò)散,表面濕潤(rùn),灰白色,周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散.如平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出銅綠假單胞菌.如平板生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)挑選2至3個(gè)菌落,分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)18至24小時(shí).取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色,鏡檢及氧化酶試驗(yàn).

氧化酶試驗(yàn)取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上,滴加新配制的1％二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液,在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性.

若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性,均判供試品未檢出銅綠假單胞菌.否則,應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn).

綠膿菌素(Pyocyanin)試驗(yàn)取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)24小時(shí),加三氯甲烷3至5毫升至培養(yǎng)管中,攪碎培養(yǎng)基并充分振搖.靜置片刻,將三氯甲烷相移至另一試管中,加入1mol/L鹽酸試液約1毫升,振搖后,靜置片刻,觀察.若鹽酸溶液呈粉紅色,為綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性.同時(shí)用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對(duì)照,陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性.

若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌,氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性,判供試品檢出銅綠假單胞菌.若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌,氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性,應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌.

(5)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)取供試液10毫升(相當(dāng)于供試品1g,1毫升,10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100毫升)的亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營(yíng)養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18至24小時(shí),必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí).取上述培養(yǎng)物,劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)24至72小時(shí).若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于表7所列特征,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌.

若平板上生長(zhǎng)的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似,應(yīng)挑選2至3個(gè)菌落,分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)18至24小時(shí).取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色,并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18至24小時(shí),作血漿凝固酶試驗(yàn).

血漿凝固酶試驗(yàn)取滅菌小試管3支,各加入血漿和無菌水混合液(1∶1)0.5毫升,再分別加入可疑菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液)0.5毫升,金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液)0.5毫升,營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5毫升,即為試驗(yàn)管,陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管.將3管同時(shí)培養(yǎng),3小時(shí)后開始觀察直至24小時(shí).陰性對(duì)照管的血漿應(yīng)流動(dòng)自如,陽(yáng)性對(duì)照管血漿應(yīng)凝固,若試驗(yàn)管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性.如陽(yáng)性對(duì)照管或陰性對(duì)照管不符合規(guī)定時(shí),應(yīng)另制備血漿,重新試驗(yàn).

若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性球菌,血漿凝固酶試驗(yàn)陰性,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌.

(6)梭菌(Clostridium)取供試液10毫升(相當(dāng)于供試品1g,1毫升)2份,其中1份置80攝氏度保溫10分鐘后迅速冷卻.上述2份供試液直接或處理后分別接種至100毫升的梭菌增菌培養(yǎng)基中,置厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí).取上述每一培養(yǎng)物0.2毫升,分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上,置厭氧條件下培養(yǎng)48至72小時(shí).若平板上無菌落生長(zhǎng),判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長(zhǎng),應(yīng)挑選2至3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過氧化氫酶試驗(yàn).

過氧化氫酶試驗(yàn)取上述平板上的菌落,置潔凈玻片上,滴加3%過氧化氫試液,若菌落表面有氣泡產(chǎn)生,為過氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性.

若上述可疑菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌,有或無卵圓形或球形的芽孢,過氧化氫酶陰性,判供試品檢出梭菌,否則判供試品未檢出梭菌.

(7)白色念珠菌(Candidaalbicans)取供試液10毫升(相當(dāng)于供試品1g,1毫升,10cm2)直接或處理后接種至適量(不少于100毫升)的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)48至72小時(shí).取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)24至48小時(shí)(必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)).

白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色偶見淡黃色,表面光滑有濃酵母氣味,培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大,顏色變深,質(zhì)地變硬或有皺摺.

若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出白色念珠菌.如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)挑選2至3個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)24至48小時(shí)(必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)).若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng),判供試品未檢出白色念珠菌.

若平板上生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色,挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24至48小時(shí).取培養(yǎng)物進(jìn)行染色,鏡檢及芽管試驗(yàn).

芽管試驗(yàn)挑取1%吐溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物,接種于加有一滴血清的載玻片上,蓋上蓋玻片,置濕潤(rùn)的平皿內(nèi),置35至37攝氏度,1至3小時(shí),置顯微鏡下觀察,可見到由孢子長(zhǎng)出短小芽管.

若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性菌,顯微鏡未見厚膜孢子,假菌絲,芽管,判供試品未檢出白色念珠菌.

結(jié)果判斷

供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí),按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn),不再?gòu)?fù)試.

供試品的細(xì)菌數(shù),霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定,應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣,獨(dú)立復(fù)試兩次,以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù).

眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時(shí),須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌,方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定.

若供試品的細(xì)菌數(shù),霉菌和酵母菌數(shù),控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定,判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定,判供試品不符合規(guī)定.

稀釋液

稀釋液配制后,應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌.

1.pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液照無菌檢查法(附錄ⅪH)制備.

2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液,pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液按緩沖液(附錄ⅩⅤD)配制后,過濾,分裝,滅菌.