中國藥典微生物技術(shù)培訓(xùn)問答會
發(fā)布時間：
2022-11-16
作者：
培養(yǎng)基問答
中國藥典培訓(xùn)問答會
請問:以第五代菌做陽性對照,實驗過程中的接種按藥典應(yīng)該也算傳代,那是否算是第六代菌呢？ 答:依然算第五代(接種的菌株算第5代,培養(yǎng)后算第6代)
其實驗結(jié)果是算哪一代菌的？ 答:見上題
藥典規(guī)定只能傳代五次,此次實驗結(jié)果是否有效？ 答:有效
現(xiàn)在有無對照菌種可以購買？聯(lián)絡(luò)電話？ 答:省藥檢所業(yè)務(wù)科銷售藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株,為第二代甘油凍存管.
菌種發(fā)放單應(yīng)包括什么信息？ 答:根據(jù)自己工作的需要,大致包括:菌種名稱,編號,來源,接收日期,接收人等.
如何檢查黑曲霉孢子懸浮液孢子含量為50~100個／ml.銅綠假單胞菌單菌如果用甘油冷凍管,也是低溫,是否也會影響它的活性？應(yīng)如何保存？ 答:可用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂來確定黑曲霉孢子懸浮液.銅綠假單胞菌應(yīng)使用最終甘油濃度為20%的甘油凍存管保存,保存在-30℃或更低溫度,則可保持其活性.若是斜面或營養(yǎng)肉湯,建議室溫保存.
工作菌株,25℃下可連續(xù)使用一周,這里的工作菌株是指原液還是制備好的菌懸液.為何工作菌株不低溫存放,而是25℃？ 答:首先要說明,所有的操作應(yīng)按藥典要求來操作,這里的工作菌株指原液,工作菌株建議在2-8℃保存,但要注意的是,銅綠假單胞菌的工作菌液不能低溫保存,低溫會損傷其活性.由于筆誤,寫成了25℃,請更正為2-8℃.
簡單方便的厭氧培養(yǎng)方案？ 答:硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基的話可考慮使用一次性厭氧袋.
甘油凍存管一定要－30℃嗎？0℃以下不可以嗎？ 答:詳見《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2010版341頁.我們的甘油凍存管保存在-30℃.
三糖鐵斜面穿刺會斷層,這是為什么？ 答:產(chǎn)氣菌產(chǎn)氣使培養(yǎng)基斷層,或培養(yǎng)基本身質(zhì)量問題.
第一代菌種可不可以作為工作菌株使用？ 答:我們不這樣使用,因為擔(dān)心菌株沒有充分復(fù)壯,生化特性可能不典型.
制備菌懸液時,要使其在10~100cfu中,應(yīng)多注意的地方是什么？ 答:制定標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程,減少不同實驗者帶來的誤差,接種量、培養(yǎng)溫度和時間應(yīng)每次一致.
銅綠假單胞菌不宜放冰箱內(nèi)保管,但其營養(yǎng)肉湯液能否放在冰箱保管？ 答:詳見《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2010版341頁.能否放冰箱可自行驗證.
黑曲霉的存放期如何驗證？ 答:通過孢子懸液計數(shù)和菌落特征,進(jìn)行驗證.
標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株必須進(jìn)行純度和特性確認(rèn)？還是在必要情況下才做？ 答:詳見《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2010版341頁,我們在制備標(biāo)準(zhǔn)貯備菌液前進(jìn)行純度和特性確認(rèn),最好在使用前再進(jìn)行純度和特性確認(rèn).
銅綠假單胞菌貯存溫度應(yīng)為多少度？ 答:一般在10℃以上,甘油凍存管至少在-30℃以下.
制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏中的保存期是否要進(jìn)行驗證？ 答:可參考2010年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP),應(yīng)進(jìn)行驗證.
驗證用菌株可否使用ATCC？ 答:如果按中國藥典檢驗的,用CMCC
菌種鑒定該如何做？ 答:請參考講義內(nèi)容.
藥典菌懸液制備是要菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18-24h再進(jìn)行稀釋,制備菌懸液,可否直接使用未過期工作菌種進(jìn)行稀釋來制備菌懸液？ 答:按藥典要求不行,如要使用,請自己驗證.
斜面低溫保藏法:每一次的菌種傳代都需要做菌種純度鑒定嗎？ 答:建議制備斜面保存管前進(jìn)行菌種純度鑒定,以后的每次傳代視具體情況而定.
如何比較快速有效判斷菌液的濃度？除了可以用“比濁儀”參考,還有什么方法？ 答:比濁儀只做輔助參考,還需通過平板計數(shù)來最后確認(rèn)菌液的濃度.
曾于中檢所中購買過黑曲霉的0代包子懸液,說明書上表示應(yīng)于-20℃中保存,可保存一年,對于此保存唯獨及效期,藥企可否同法保存自制的黑曲霉孢子懸液？是否要驗證？如何驗證？ 答:黑曲霉孢子懸液制備請參照2010版藥典的相關(guān)內(nèi)容.關(guān)于驗證在前面的問題中已經(jīng)回復(fù).
菌種純度確認(rèn),怎么確認(rèn),需確認(rèn)哪些項目？ 答:請參照2010版藥典的相關(guān)內(nèi)容.
細(xì)菌菌種接入營養(yǎng)肉湯中保存一周,這需要驗證嗎？ 答:建議做驗證.
菌種斜面最多能保存菌幾代？經(jīng)冰箱保存的斜面菌種是否需復(fù)蘇二次才能進(jìn)行菌懸液配制？ 答:藥典規(guī)定,菌種傳代不應(yīng)超過5代.冰箱保存的斜面菌種復(fù)蘇后即可使用.
革蘭氏染色的時間一般多長時間,染色時間長了對結(jié)果有無影響？ 答:詳見講義內(nèi)容,應(yīng)嚴(yán)格控制染色時間,否則對結(jié)果影響很大.
哥倫比亞血瓊脂平皿生長的菌落,對氧化酶試驗是否有影響？菌懸液的制備過程中,接種菌種新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,這個新鮮培養(yǎng)物怎么理解,冰箱保存斜
面菌種是新鮮培養(yǎng)物嗎？ 答:沒使用過哥倫比亞血瓊脂及相關(guān)實驗.新鮮培養(yǎng)物指剛培養(yǎng)好的菌株,冰箱保存斜面菌種不算新鮮培養(yǎng)物.
菌種鑒定時,一定要根據(jù)藥典的所有試驗做完,才能確認(rèn)是某種菌株嗎？可否省略一些試驗？ 答:請按藥典規(guī)定來進(jìn)行菌種鑒定,具體情況可能還要增加適宜的鑒定試驗.
工作菌株可在25℃連續(xù)使用一周,是指同一代同一管的菌株嗎？還是說同一代不同管的菌株？ 答:筆誤更正,同上一題.
若沒有比濁儀,用什么方法來確認(rèn)50~100cfu/ml？特別是孢子？ 答:孢子計數(shù)建議通過平板計數(shù)的方法來確定濃度.
工作菌種是否可以使用后再次冷藏使用(斜面保藏法)？ 答:請自行掌握.
大腸埃希菌鏡檢時,有時固定好的菌在染色過程中脫落,請問是什么原因引起這種情況？ 答:首先,洗干凈撥片,挑菌注意不要太多,待菌固定好后再進(jìn)行染色.
生孢梭菌,菌落培養(yǎng)計數(shù)時一定要在厭氧條件下進(jìn)行嗎？ 答:是
菌懸液怎樣在24h內(nèi)確定其菌落數(shù)？請講解細(xì)菌和真菌的方法. 答:平板計數(shù)方法.
生孢梭菌培養(yǎng)時,怎樣做才能使其在厭氧中培養(yǎng)？ 答:詳見2010版藥典
菌種的純度鑒定包括哪些內(nèi)容？如果是跟省藥檢所買的3代菌是否就不用做純度或確認(rèn)試驗？ 答:省所現(xiàn)在銷售的是第二代的甘油冷凍管,嚴(yán)格來說,請做純度確認(rèn).
為什么有時候細(xì)菌管會長真菌,而真菌管也會長細(xì)菌. 答:原因可能是多方面的,某些細(xì)菌適宜在真菌培養(yǎng)基上生長,而某些真菌也能在細(xì)菌培養(yǎng)基上生長.比如2010版藥典無菌檢查法,兩種培養(yǎng)基的使用范圍已刪去,已不是絕對的細(xì)菌培養(yǎng)基或真菌培養(yǎng)基.
在做方法驗證時,黑曲霉菌濃度大于20cfu/皿時,培養(yǎng)5天后菌落蔓延擴散,無法各個區(qū)分,如何在藥典要求的50~100cfu和實際操作結(jié)果中找到平衡？因為菌濃對回收率及操作RSD%影響很多. 答:培養(yǎng)48-72h后,菌落剛形成時,及時點計并做記號,然后每天觀察有無新的菌落長出并計數(shù).
標(biāo)準(zhǔn)菌黑曲霉在傳代前需要先接到改良馬丁培養(yǎng)基復(fù)蘇后,再傳代,如果需要,接到改良馬丁培養(yǎng)基后培養(yǎng)時間怎么定？ 答:2010版藥典規(guī)定,黑曲霉傳代,培養(yǎng)時間為5~7天
有時候在玫瑰紅鈉瓊脂或營養(yǎng)瓊脂平板上生長有酵母菌,在酵母菌生長的位置底部產(chǎn)生了一個氣泡狀的圓形,把底部的瓊脂都貢起來了,又或者表面沒有任何菌落,而瓊脂被貢起來,請問這種圓形氣泡是菌嗎？在計數(shù)時是否也把它算入酵母菌？ 答:建議挑取氣泡內(nèi)含物接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中,若能生長,且為酵母菌的菌落形態(tài),應(yīng)該可以將其算入酵母菌.
大腸生化實驗中的靛基質(zhì)試驗(I)項結(jié)果為“+”或者“-”均不影響最終結(jié)果的判斷,請問該項的意義何在？是否可以取消？ 答:反應(yīng)為+,為典型大腸埃希氏菌,-為非典型大腸埃希菌.關(guān)系到最終判斷,都是必須的實驗,不可取消.
生化檢查用的鑒定盒是否需要跟培養(yǎng)基一樣做適用性檢查？如果需要做,應(yīng)該如何進(jìn)行？ 答:用陽性菌做一次,實驗結(jié)果相符即可.
銅綠假單胞菌用什么方法保存及更活處理方法？ 答:建議采用甘油凍存管(終濃度為20%的甘油凍存管),-30℃(或更低溫度)保存.
工作菌種每代可保存多長時間(斜面低溫保藏法)才傳下一代？ 答:教科書上的保存時間為1-6個月.
工作菌株的使用記錄(時間、用途、使用者等)是否需要建立臺賬？ 答:是
菌株的純度和特性要多久確認(rèn)一次,最短時間和最長時間分別是多少？ 答:做標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株之前務(wù)必要進(jìn)行鑒定,其它根據(jù)實際情況:如污染、活性下降、儲存條件發(fā)上改變等.
革蘭氏染色前,菌落是否要先純化(接到營養(yǎng)瓊脂斜面上)還是直接從選擇性培養(yǎng)基上挑起菌落直接染色？ 答:要純化,從選擇性培養(yǎng)基挑取單個菌落,最好先接到營養(yǎng)瓊脂斜面后,再進(jìn)行染色.
真菌接至改良馬丁液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)時間為多長？(白色念珠菌、黑曲霉) 答:見2010版藥典.
菌種鑒定一定要做到生化鑒定嗎？ 答:要.可以選擇傳統(tǒng)的生化試驗鑒定,也可選擇鑒定儀或鑒定試劑條.請視自身情況而定.
是否可按10版藥典中抑制控制菌檢驗判定方法進(jìn)行？比如金葡菌做甘露醇平板分離,革蘭染色,血漿凝固酶為陽性就可以了. 答:金葡這樣做可以.其他菌株視具體情況而選擇適宜的鑒定試驗.
請介紹一下,有什么簡便的方法滅菌甘油？ 答:高壓濕熱滅菌法
黑曲霉孢子懸液貯存期驗證怎么做. 答:請參考前面該問題的答復(fù).
銅綠假單胞菌瓊脂斜面變紅,是否會造成菌種變異？如何避免該情況出現(xiàn)？(本菌株于25℃保存) 答:出現(xiàn)這樣的情況建議對菌種純度進(jìn)行鑒定.實驗操作請注意防止污染.
沙門菌穿刺于三塘鐵瓊脂斜面后,由試管底部向上分別出現(xiàn)黃→黑→紅,三種顏色,如何解釋？ 答:請看講義內(nèi)容.
銅綠假單胞菌菌懸液是否也可在2~8℃保存,24小時內(nèi)使用？ 答:不建議,請自己驗證.
是否一定要使用CMCC的菌株嗎？ 答:藥典是這樣規(guī)定的.
假如使用ATCC的菌株代替CMCC的可以嗎？ 答:請按藥典規(guī)定來進(jìn)行實驗,若是藥品檢驗,請用CMCC菌株.
可以用液氮保藏甘油冷凍管嗎？可以的話應(yīng)該怎么操作？ 答:可以.具體操作不清楚.我們沒有液氮保存罐.
貴所有開展支原體檢查法這個實驗嗎？ 答:沒有
制備菌懸液的時候,培養(yǎng)物用的營養(yǎng)肉湯用量是多少？ 答:沒有具體規(guī)定,請自行制定.
制備菌懸液的時候怎樣保證他是50cfu呢？具體說一下操作方法 答:自行摸索一套方法,固定下來,以后就按該方法做就可以了.
請問菌種斜面最好多長時間轉(zhuǎn)接一次？ 答:參考上一題.
20%甘油v∕v是用水還是用相應(yīng)培養(yǎng)基做稀釋？ 答:用相應(yīng)的培養(yǎng)基.
驗證或做培養(yǎng)基的適用性檢查時,若實際操作制得的菌懸液,經(jīng)測定計數(shù)后不在規(guī)定的范圍內(nèi),如＞100cfu,是否應(yīng)判本次實驗無效,應(yīng)重試？若試菌,真菌生長較慢,不能短期內(nèi)預(yù)算菌數(shù),如何解決？ 答:第一個問題,請重試.第二個問題,請注意積累平時實驗經(jīng)驗,標(biāo)準(zhǔn)化操作,慢慢摸索稀釋的倍數(shù).
有時候酵母菌在玫瑰紅鈉平板上不易觀察,是否可用孟加拉瓊脂培養(yǎng)基代替來作培養(yǎng)？ 答:藥品檢驗請嚴(yán)格按藥典規(guī)定,若是平時科研,應(yīng)該可以用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基代替.
菌種的每一次傳代(如3代→4代→5代)都必須做菌種鑒定實驗嗎？ 答:視具體情況而定.
如何控制菌液的濃度為50～100cfu/ml？ 答:見前面問題的回復(fù).
菌種的傳代,營養(yǎng)肉湯或改良馬丁0.5ml～0.8ml復(fù)蘇凍干菌粉→直接涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)箱→是第一代還是第二代？ 答:凍干菌粉為第0代,若凍干菌粉未經(jīng)過培養(yǎng),直接涂布到培養(yǎng)基上,為第1代.
請教一個有關(guān)微生物限度檢查的問題,在制備10～100cfu菌液時除了你說的比濁法,比較普遍的就是平板計數(shù)法,而其中用到的六種試驗菌,細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂計數(shù),霉菌用玫瑰紅鈉瓊脂平板計數(shù),其它四種菌應(yīng)用何種培養(yǎng)基計數(shù)？ 答:不知道此處所說的其他4種指的是什么菌.
只用平板計數(shù),結(jié)果準(zhǔn)確嗎？還有沒有其他方法制備10～100cfu菌懸液？ 答:這是一個很好的課題,若感興趣,你們可以好好研究一下.
什么叫比濁法(黑曲霉)？ 答:關(guān)于比濁法的定義和原理,請上網(wǎng)查百度百科,上面有詳細(xì)的講解.
大腸埃希菌檢查中,MUG培養(yǎng)基配制后顯熒光是什么原因？ 答:有可能試管玻璃材質(zhì)自發(fā)熒光,也可能清洗不干凈,或培養(yǎng)基本身質(zhì)量,比如有無發(fā)生污染等.
請問可用何種培養(yǎng)基或手段鑒定枯草芽孢桿菌？eg:大腸埃希菌用EMB,金黃色葡萄球菌用甘露醇 答:目前尚未有合適的選擇性培養(yǎng)來鑒定枯草芽孢桿菌,可選用API或細(xì)菌鑒定儀等手段來鑒定.
如何制備50~100cfu的懸液？有什么方法可以測定具體濃度？ 答:參考上題
請問:細(xì)菌鑒定儀有哪些用途？能夠鑒定沙門菌屬下的各種沙門菌么？怎樣應(yīng)用？ 答:如有需要,可聯(lián)系梅里埃的技術(shù)支持人員:13503006367霍工.他會詳細(xì)解答你想問的問題.
黑曲霉菌在2~8℃保存經(jīng)驗證后能否延長使用時間？ 答:藥典規(guī)定在驗證過的期限內(nèi)使用.
菌種的保藏可否用液體石蠟保藏？與甘油冷凍保藏有何區(qū)別？ 答:藥典未記載液體石蠟保藏法,部分參考書記載斜面保藏法或半固定保藏法可加滅菌石蠟覆蓋.
用于驗證試驗的菌株是否經(jīng)驗證均能承受1000ml沖洗？ 答:未驗證,請咨詢藥典會.
傳代支原體和其它的菌種一樣嗎？ 答:不清楚
什么叫亞培養(yǎng)？ 答:請咨詢藥典會.
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