微生物學實驗室培養(yǎng)基的質(zhì)量控制
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
微生物學實驗室培養(yǎng)基的質(zhì)量控制
培養(yǎng)基在任何一個微生物實驗室中都起到關鍵的作用,它廣泛用于不同病原微生物的分離、鑒定和藥物敏感性測定.大多數(shù)實驗室經(jīng)常自己制備培養(yǎng)基用于診斷和研究.但是為確保培養(yǎng)基的質(zhì)量并能夠提供令人滿足的結(jié)果,適當?shù)馁|(zhì)量治理系統(tǒng)是必要的.為了這個目的,制備好的培養(yǎng)基在使用之前應檢查幾個參數(shù).
本文的目的就為確保培養(yǎng)基質(zhì)量對需要考慮的參數(shù)及所需試驗進行討論,并根據(jù)需要評價的參數(shù)把培養(yǎng)基質(zhì)控的程序分為幾個部分.
一、原材料參數(shù)
培養(yǎng)基的質(zhì)量直接依靠于用來制備培養(yǎng)基的原材料的質(zhì)量.水是制備培養(yǎng)基最主要的原材料,需要檢測的參數(shù)有銅離子的含量,導電性和pH.最理想的情況應該是水中不含銅離子,由于它抑制微生物的生長.導電性應該小于15μS(微西門子).水的pH應偏酸,但是不能小于5.1.
傾倒培養(yǎng)基所用的帶蓋培養(yǎng)皿也是一個重要的因素.一般培養(yǎng)皿是經(jīng)環(huán)氧乙烯(ETO)滅菌或是γ射線照射滅菌的.假如是用ETO滅菌的應該檢測殘余的ETO毒性,由于它可能影響微生物的生長.ETO可以用標準的氣相色譜的方法測定,其最大的答應殘余量為1μg/g.如使用玻璃器皿只可用硼硅酸鹽的,由于碳酸鹽玻璃可以將堿瀝濾到培養(yǎng)基中.
培養(yǎng)基的制備中還要用到很多添加劑,其中最重要的是血.所以血的質(zhì)量對含血培養(yǎng)基的質(zhì)量起至關重要的作用.在制備培養(yǎng)基之前應該小心檢查血的無菌性、同質(zhì)性、粘性和顏色.對于其它的添加劑,應該考慮分析的證實書和滅菌情況.
二、滅菌參數(shù):
培養(yǎng)基滅菌在培養(yǎng)基的質(zhì)量中具有重要作用.一般用自動高壓鍋進行培養(yǎng)基滅菌.但是,高壓的時間和培養(yǎng)基的量要嚴格控制.復合培養(yǎng)基經(jīng)熱處理可能由于直接的熱降解或者是成分之間的反應可能造成營養(yǎng)成分的丟失.所以優(yōu)化加熱過程把熱損失降到最小是非常重要的.建議使用的循環(huán)是第1階段:20～121,第2階段:<100～121,第3階段:121～121,第4階段:121～80.
一次消毒的培養(yǎng)基體積應較少,最好是2升.常規(guī)應用指示劑監(jiān)測滅菌過程;溫度和壓力應該經(jīng)常檢測.可用滅菌指示劑如生物指示劑和BowieDick實驗檢查滅菌過程的有效性.可用生物指示劑如嗜熱脂肪芽孢桿菌監(jiān)測殺傷芽孢的效果.
三、物理參數(shù)
培養(yǎng)基的表面特征可表明質(zhì)量的好壞.應該檢查培養(yǎng)基的物理參數(shù)包括:有無過量的氣泡或坑,培養(yǎng)皿填充是否均勻,培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基有無裂開、冰凍或結(jié)晶.
所有上述提到的參數(shù)可以通過肉眼檢查.但是培養(yǎng)基填充的均勻程度、培養(yǎng)基的厚度可以在4個點檢查.這是4點是指培養(yǎng)皿兩個成恰當?shù)慕嵌鹊闹睆降膬蓚€端點,這樣可同時檢測到四個面.記錄4個點的厚度并計算均勻厚度.培養(yǎng)皿的厚度以均勻厚度表示,應該在4.0±0.2mm之內(nèi).
培養(yǎng)基的pH值也是一個必須要檢測的重要物理參數(shù).可通過用標準的用標準液矯正過的pH計丈量制備好的待高壓的培養(yǎng)基確定.
四、微生物參數(shù)
生長支持特性是培養(yǎng)基質(zhì)控中最重要的參數(shù),需要用標準的接種方法進行定性定量檢測.并且在測定新的批號時,應該同時接種新批號和舊批號.
臨床實驗室標準國家委員會(NCCLS)已經(jīng)為各種培養(yǎng)基所用質(zhì)控微生物的理想接種濃度和預期的結(jié)果列出了一些指導原則.每種培養(yǎng)基的接種可按如下方法預備:
質(zhì)控微生物接種于大豆酪蛋白消化(SCD)肉湯培養(yǎng)基中,孵育4小時獲得相當于0.5個麥氏標準管的濃度的細菌.這種標準濃度的細菌懸液應該能獲得107-108cfu/mL(625nm的吸光度為0.08～0.1).選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基應分別接種10uL10倍和100倍普通生理鹽水或SCD肉湯稀釋的菌液.這些稀釋的菌液用來評估價培養(yǎng)基的生長支持特性.每一種接種物做雙份接種.接種后將培養(yǎng)皿放置在37攝氏度24小時,觀察菌落的特性和生長特性.結(jié)果報告可在如下表格中填寫有無生長以及生長特性.
H實際上,盡對的微生物生長的測定或者耗時的或者需要特殊的儀器設備.菌落大小可以用來表明生長特性,但也是不敏感的指標.菌落特征的觀察是主觀的,且難以記錄.
像流行病學方法及可提供可比較數(shù)據(jù)的比例方法適合于常規(guī)的培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)特性的質(zhì)量控制,可用于檢測培養(yǎng)基的生長和抑制特性.
五、流行病學方法
這是一種簡單的數(shù)學方法.同時測定盡對生長指數(shù)(AGI)和相對生長指數(shù)(RGI).這種方法基于將接種物不斷劃線直至細菌消失.這種方法可以用來比較不同批號的培養(yǎng)基也可以用來比較選擇性和非選擇性培養(yǎng)基.
這種方法是將一滿菌環(huán)的選定的實驗菌株接種到5ml心腦浸汁肉湯培養(yǎng)基中孵育4小時.將含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿分成4部分并按如圖所示方法劃線.
用一個微升菌環(huán)挑一滿環(huán)培養(yǎng)物并按A1,B1,C1,D1,A2,B2..直到D5的方法劃線,中間不用燒菌環(huán)也不用再挑菌液.用同樣方法在質(zhì)控平板上操縱.孵育后記錄測試板和質(zhì)控板出現(xiàn)培養(yǎng)物的最后的點.這就是測試板和質(zhì)控板的終點.這些結(jié)果可以用來計算培養(yǎng)基的AGI和RGI.AGI通過記錄終點得到.
RGI是測試板和質(zhì)控板AGI的比值.
RGI隨著培養(yǎng)基的用途而變化.為了檢查有效性,RGI應接近100%.但是為了檢測抑制性,RGI應接近0%.選擇性瓊脂的特性可以用一個用來測試分離特性的菌株和一個用來測試抑制特性的菌株進行測定.
六、生產(chǎn)率(PR)
測定培養(yǎng)基的生產(chǎn)率是測定代測培養(yǎng)基相對于質(zhì)控培養(yǎng)基的特性的另一種方法,指控培養(yǎng)基應該是一種營養(yǎng)瓊脂如胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA).所用接種物必須相同,PR通過計算測試和質(zhì)控培養(yǎng)基上的克隆數(shù)得到.
PR=測試板上的克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)
質(zhì)控板上的克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)
這種方法是對Miles和Misra技術的改進.將測試用的培養(yǎng)物過夜培養(yǎng),用緩沖蛋白胨水做10倍倍比稀釋.將測試板分成4等份,并且每一部分標記好所用培養(yǎng)物的稀釋倍數(shù).(如圖2)
從高濃度開始,將相應稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)物放在相應的1/4圓內(nèi).并對質(zhì)控板做同樣的操縱.將每滴培養(yǎng)物在相應的1/4圓內(nèi)涂布,并在37攝氏度培養(yǎng)18小時.計數(shù)測試和質(zhì)控板最低稀釋倍數(shù)的克隆數(shù).
七、污染參數(shù)
這也是決定培養(yǎng)基質(zhì)量非常重要的因素,一批培養(yǎng)基在使用之前必須仔細檢查污染情況.建議將一批制備的培養(yǎng)基在室溫放3天以檢查污染情況.或者從一批測試培養(yǎng)基中拿出兩個放在孵箱內(nèi)37攝氏度孵育24小時.經(jīng)必要的孵育后,檢查有無生長.假如有生長,從同一批制備的培養(yǎng)基中再拿出兩個,重復上述過程一次.假如再次出現(xiàn)污染,表明制備的這一批培養(yǎng)基有污染.建議當一批培養(yǎng)基污染超過10%應棄往.
八、凝膠強度參數(shù)
凝膠強度表明培養(yǎng)基中瓊脂凝固的程度.凝膠強度通過一個三角架進行丈量,這個三角架中心有一個棒,用來給瓊脂加壓.這個棒的底端有一個圓形的部分,用來放在培養(yǎng)基表面.棒的頂端有一個平臺,平臺上可以放定量的砝碼.中心棒的球形的部分放在培養(yǎng)基上,砝碼一個一個地放在上面的平臺上并觀察一段時間.直到瓊脂在中心棒的壓力下斷裂.計算瓊脂的強度時須忽略中心棒的重量.中心棒施加在瓊脂表面的壓力可以通過下面的公式計算:Wpr2.公式中的w為放在平臺上的砝碼的重量,r為中心棒底端球形部分的半徑.P=3.14.大約300-500dynes/cm2的凝膠強度是比較滿足的.
九、現(xiàn)狀
用于臨床微生物實驗室培養(yǎng)基的質(zhì)控對從感染的病人體內(nèi)獲得正確的可解釋的分離菌株是非常關鍵的.用標準的方法檢測培養(yǎng)基可以節(jié)省時間和資源.最近在安大略湖質(zhì)控應用情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)人們根本沒有按NCCLSQA的建議往做.而且建議使用的ATCC菌株只有一半的實驗室使用.培養(yǎng)基的批失敗率在0.10%-9.87%之間(均勻1.01%).失敗的原因有不生長(39.9%),不抑制(18.6%),非無菌(17.9%),溶血(7.2%)和表面破壞(16.3%).另外一項調(diào)查發(fā)現(xiàn)批失敗率較小(0.5%).Krisher等指出109個被調(diào)查的實驗室中有41個使用50%或更少NCCLSM22-A2提供的信息.在最近的NCCLSM22-A3文件中將培養(yǎng)基按質(zhì)控失敗率進行分類.失敗率大于0.5%的培養(yǎng)基需要使用者做全部的質(zhì)控,被稱之為非免除培養(yǎng)基,如營養(yǎng)肉湯,Todd-Hewitt肉湯,麥康凱山梨醇瓊脂,含有IsoVitaleX的巧克力瓊脂,(r)Campylobacter血瓊脂,含有5%羊血和環(huán)己酰亞胺的心腦浸液(BHI).失敗率小于或即是0.5%的培養(yǎng)基是免除培養(yǎng)基,建議只做最低限度的質(zhì)控.可以節(jié)省本錢避免不必要的重復質(zhì)控.