試驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)量控制程序
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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培養(yǎng)基是微生物試驗(yàn)的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗(yàn)結(jié)果。適宜的制備方法，貯藏條件和質(zhì)量控制試驗(yàn)是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。
在制備時(shí)，應(yīng)選擇質(zhì)量符合要求的脫水培養(yǎng)基或單獨(dú)配方組分進(jìn)行配制。且應(yīng)附有處方和使用說明，配制時(shí)應(yīng)按使用說明上的要求操作以確保培養(yǎng)基的質(zhì)量符合要求，不得使用結(jié)塊或顏色發(fā)生改變的產(chǎn)品。脫水培養(yǎng)基或單獨(dú)配方組分應(yīng)在適當(dāng)?shù)臈l件下儲(chǔ)存，如低溫，干燥和避光，所有的容器應(yīng)密封，尤其是盛放容器。商品化的成品培養(yǎng)基除了應(yīng)附有處方和使用說明外，還應(yīng)注明有效期，貯存條件，適用性檢查試驗(yàn)的質(zhì)控菌和用途。
為保證質(zhì)量的穩(wěn)定可靠，各脫水培養(yǎng)基或各配方組分應(yīng)準(zhǔn)確稱量，并要求有一定的精確度。配制最常用的溶劑是純化水，特殊情況下，可能需要用去離子水和蒸餾水。應(yīng)記錄各稱量物的重量和水的使用量。配制所用容器和配套器具應(yīng)潔凈，可用純化水沖洗玻璃器皿以消除清潔劑和外來物質(zhì)的殘留。對(duì)熱敏感的如糖發(fā)酵培養(yǎng)基其分裝容器一般應(yīng)預(yù)先進(jìn)行滅菌，以保證無菌性。
脫水型培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解于水中，再行分裝與滅菌。配制時(shí)若需要加熱助溶，應(yīng)注意不要過度加熱，以避免顏色變深。如需要添加其它組分時(shí)，加入后應(yīng)充分混勻。
應(yīng)按照生產(chǎn)商提供或使用者驗(yàn)證的參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌。商品化的成品培養(yǎng)基必須附有所用滅菌方法的資料。滅菌一般采用濕熱滅菌技術(shù)，特殊的可采用薄膜過濾除菌。若采用不適當(dāng)?shù)募訜岷蜏缇鷹l件，有可能引起顏色變化，透明度降低，瓊脂凝固力或 pH 的改變。因此，培養(yǎng)基應(yīng)采用驗(yàn)證的滅菌程序滅菌，培養(yǎng)基滅菌方法和條件，應(yīng)通過無菌性試驗(yàn)和促生長試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，對(duì)高壓滅菌器的蒸汽循環(huán)系統(tǒng)也要加以驗(yàn)證，以保證在一定裝載方式下的正常熱分布。溫度緩慢上升的高壓滅菌器可能導(dǎo)致過熱，過度滅菌可能會(huì)破壞絕大多數(shù)的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基促生長的質(zhì)量。滅菌器中的容積和裝載方式也將影響加熱的速度。因此，應(yīng)根據(jù)滅菌的特性，進(jìn)行全面的滅菌程序驗(yàn)證。
應(yīng)確定每批滅菌后的 pH（冷卻至室溫 25攝氏度測(cè)定）。若處方中列出 pH 的范圍，除非經(jīng)驗(yàn)證表明培養(yǎng)基的 pH 允許的變化范圍很寬，否則，pH的范圍不能超過規(guī)定的±0.2。
制成平板或分裝于試管的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行下列檢查：容器和蓋子不得破裂，裝量應(yīng)相同，盡量避免形成氣泡，固體培養(yǎng)基表面不得產(chǎn)生裂縫或漣漪，在冷藏溫度下不得形成結(jié)晶，不得污染微生物等。應(yīng)檢查和記錄批數(shù)量，有效期及無菌檢查。
貯存自配的培養(yǎng)基應(yīng)標(biāo)記名稱，批號(hào)，配制日期等信息，并在已驗(yàn)證的條件下貯藏。標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)有名稱，批號(hào)，生產(chǎn)日期，失效期及有關(guān)特性，生產(chǎn)商和使用者應(yīng)根據(jù)使用說明書上的要求進(jìn)行保存，所采用的保藏和運(yùn)輸條件應(yīng)使成品培養(yǎng)基最低限度的失去水分并提供機(jī)械保護(hù)。
滅菌后若儲(chǔ)藏在高壓滅菌器中，質(zhì)量可能會(huì)受影響，一般不提倡這種存放法。瓊脂培養(yǎng)基不得在 0攝氏度或 0攝氏度以下存放，因?yàn)槔鋬隹赡芷茐哪z特性。
應(yīng)避光保存，若要長期保存，應(yīng)置于密閉容器中以防止水分流失。瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保存，一般不超過一周，且應(yīng)密閉包裝，若延長保存，保存期需經(jīng)驗(yàn)證確定。
滅菌后的再融化只允許一次，以避免因過度受熱造成質(zhì)量下降或微生物污染。培養(yǎng)基的再融化一般采用的水浴加熱或流通蒸汽。若使用微波爐，應(yīng)避免過度受熱及水分的蒸發(fā)，更要注意安全。融化后應(yīng)置于 45～50攝氏度的水浴中，不得超過 8 小時(shí)。傾注時(shí)，應(yīng)擦干容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴進(jìn)入造成污染。
使用過的培養(yǎng)基（包括失效的）應(yīng)按照國家污染廢物處理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。
質(zhì)量控制試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)試驗(yàn)用培養(yǎng)基建立質(zhì)量控制程序（也就是要有培養(yǎng)基質(zhì)控sop），以確保所用產(chǎn)品的質(zhì)量符合相關(guān)檢測(cè)的需要。
實(shí)驗(yàn)室配制或商品化的成品的質(zhì)量依賴于其制備過程，采用不適宜方法制備的培養(yǎng)基將影響微生物的生長或復(fù)蘇，從而影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
配制好的產(chǎn)品應(yīng)定期進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室配制的常規(guī)監(jiān)控項(xiàng)目是 pH，適用性檢查試驗(yàn)，定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期。在有效期內(nèi)應(yīng)依據(jù)適用性檢查試驗(yàn)確定質(zhì)量是否符合要求。有效期的長短將取決于在一定存放條件下（包括容器特性及密封性）的培養(yǎng)基其組成成分的穩(wěn)定性。
在實(shí)驗(yàn)室中，若采用已驗(yàn)證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同一的適用性檢查試驗(yàn)可只進(jìn)行一次，試驗(yàn)的菌種可根據(jù)用途從相關(guān)附錄中進(jìn)行選擇，也可增加從生產(chǎn)環(huán)境及產(chǎn)品中常見的污染菌株。質(zhì)量控制試驗(yàn)若不符合規(guī)定，應(yīng)尋找不合格的原因，以防止問題重復(fù)出現(xiàn)。任何不符合要求的均不能使用。
用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基須特別防護(hù)。用于關(guān)鍵區(qū)域監(jiān)控的最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的，那么在使用前應(yīng)進(jìn)行100%的預(yù)培養(yǎng)以防止外來的污染物帶到環(huán)境中及避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
其實(shí)在我們微生物實(shí)驗(yàn)室，質(zhì)控一直都是很多實(shí)驗(yàn)室很困擾的一個(gè)問題，好好研讀GB 4789.28-2013 《培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》，相信對(duì)大家還是很有幫助的。
培養(yǎng)基在任何一個(gè)微生物實(shí)驗(yàn)室中都起到關(guān)鍵的作用，它廣泛用于不同病原微生物的分離，鑒定和藥物敏感性測(cè)定。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常自己制備培養(yǎng)基用于診斷和研究。但是為確保其質(zhì)量并能夠提供令人滿足的結(jié)果，適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量治理系統(tǒng)是必要的。為了這個(gè)目的，在使用之前應(yīng)檢查幾個(gè)參數(shù)。
本文的目的就為確保培養(yǎng)基質(zhì)量對(duì)需要考慮的參數(shù)及所需試驗(yàn)進(jìn)行討論，并根據(jù)需要評(píng)價(jià)的參數(shù)把質(zhì)控的程序分為幾個(gè)部分。
一，原材料參數(shù)：培養(yǎng)基的質(zhì)量直接依靠于用來制備的原材料的質(zhì)量。水是制備最主要的原材料，需要檢測(cè)的參數(shù)有銅離子的含量，導(dǎo)電性和pH。最理想的情況應(yīng)該是水中不含銅離子，由于它抑制微生物的生長。導(dǎo)電性應(yīng)該小于15μS(微西門子)。水的pH應(yīng)偏酸，但是不能小于5.1[1]。
傾倒培養(yǎng)基所用的帶蓋培養(yǎng)皿也是一個(gè)重要的因素。一般培養(yǎng)皿是經(jīng)環(huán)氧乙烯(EtO)滅菌或是γ射線照射滅菌的。假如是用EtO滅菌的應(yīng)該檢測(cè)殘余的EtO毒性，由于它可能影響微生物的生長。EtO可以用標(biāo)準(zhǔn)的氣相色譜的方法測(cè)定，其最大的答應(yīng)殘余量為1μg/g。如使用玻璃器皿只可用硼硅酸鹽的，由于碳酸鹽玻璃可以將堿瀝濾到培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)基的制備中還要用到很多添加劑，其中最重要的是血。所以血的質(zhì)量對(duì)含血培養(yǎng)基的質(zhì)量起至關(guān)重要的作用。在制備之前應(yīng)該小心檢查血的無菌性，同質(zhì)性，粘性和顏色。對(duì)于其它的添加劑，應(yīng)該考慮分析的證實(shí)書和滅菌情況。
二，滅菌參數(shù)：滅菌在培養(yǎng)基的質(zhì)量中具有重要作用。一般用自動(dòng)高壓鍋進(jìn)行滅菌。但是，高壓的時(shí)間和量要嚴(yán)格控制。復(fù)合培養(yǎng)基經(jīng)熱處理可能由于直接的熱降解或者是成分之間的反應(yīng)可能造成營養(yǎng)成分的丟失。所以優(yōu)化加熱過程把熱損失降到最小是非常重要的。建議使用的循環(huán)是第1階段：20～121攝氏度，第2階段：<100～121攝氏度，第3階段：121～121攝氏度，第4階段：121～80攝氏度。
一次消毒的體積應(yīng)較少，最好是2升。常規(guī)應(yīng)用指示劑監(jiān)測(cè)滅菌過程；溫度和壓力應(yīng)該經(jīng)常檢測(cè)。可用滅菌指示劑如生物指示劑和Bowie Dick實(shí)驗(yàn)檢查滅菌過程的有效性?？捎蒙镏甘緞┤缡葻嶂狙挎邨U菌監(jiān)測(cè)殺傷芽孢的效果。
三，物理參數(shù)：培養(yǎng)基的表面特征可表明質(zhì)量的好壞。應(yīng)該檢查的物理參數(shù)包括：有無過量的氣泡或坑，培養(yǎng)皿填充是否均勻，培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基有無裂開，冰凍或結(jié)晶。
所有上述提到的參數(shù)可以通過肉眼檢查。但是填充的均勻程度，厚度可以在4個(gè)點(diǎn)檢查。這是4點(diǎn)是指培養(yǎng)皿兩個(gè)成恰當(dāng)?shù)慕嵌鹊闹睆降膬蓚€(gè)端點(diǎn)，這樣可同時(shí)檢測(cè)到四個(gè)面。記錄4個(gè)點(diǎn)的厚度并計(jì)算均勻厚度。培養(yǎng)皿的厚度以均勻厚度表示，應(yīng)該在4.0± 0.2 mm之內(nèi)。
培養(yǎng)基的pH值也是一個(gè)必須要檢測(cè)的重要物理參數(shù)?？赏ㄟ^用標(biāo)準(zhǔn)的用標(biāo)準(zhǔn)液矯正過的pH計(jì)丈量制備好的待高壓的培養(yǎng)基確定。
四，微生物參數(shù)：生長支持特性是培養(yǎng)基質(zhì)控中最重要的參數(shù)，需要用標(biāo)準(zhǔn)的接種方法進(jìn)行定性定量檢測(cè)。并且在測(cè)定新的批號(hào)時(shí)，應(yīng)該同時(shí)接種新批號(hào)和舊批號(hào)。
臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)國家委員會(huì)（NCCLS）已經(jīng)為各種培養(yǎng)基所用質(zhì)控微生物的理想接種濃度和預(yù)期的結(jié)果列出了一些指導(dǎo)原則。每種培養(yǎng)基的接種可按如下方法預(yù)備：
質(zhì)控微生物接種于大豆酪蛋白消化(SCD)肉湯培養(yǎng)基中，孵育4小時(shí)獲得相當(dāng)于0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管的濃度的細(xì)菌。這種標(biāo)準(zhǔn)濃度的細(xì)菌懸液應(yīng)該能獲得107-108cfu/毫升（625nm的吸光度為0.08～0.1）。選擇性和非選擇性培養(yǎng)基應(yīng)分別接種10uL 10倍和100倍普通生理鹽水或SCD肉湯稀釋的菌液。這些稀釋的菌液用來評(píng)估價(jià)培養(yǎng)基的生長支持特性。每一種接種物做雙份接種。接種后將培養(yǎng)皿放置在37°C 24小時(shí)，觀察菌落的特性和生長特性。結(jié)果報(bào)告可在如下表格中填寫有無生長以及生長特性。
實(shí)際上，盡對(duì)的微生物生長的測(cè)定或者耗時(shí)的或者需要特殊的儀器設(shè)備。菌落大小可以用來表明生長特性，但也是不敏感的指標(biāo)。菌落特征的觀察是主觀的，且難以記錄。
像流行病學(xué)方法及可提供可比較數(shù)據(jù)的比例方法適合于常規(guī)的培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)特性的質(zhì)量控制，可用于檢測(cè)培養(yǎng)基的生長和抑制特性。