培養(yǎng)基選擇性分離稀有放線菌的方法
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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培養(yǎng)基選擇性分離稀有放線菌的方法
放線菌作為新的生物活性代謝產(chǎn)物的主要來(lái)源早已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn).自從鏈霉菌素的發(fā)現(xiàn) , 大量抗生素從Streptomyces 和Streptovertieilliura分離得到, 例如氯霉素、氨基苷類、 四環(huán)素、 大環(huán)內(nèi)酯類和頭孢霉素等….因此,放線菌被認(rèn)為是一類具有重要經(jīng)濟(jì)及研究?jī)r(jià)值的微生物.長(zhǎng)期的研究重點(diǎn)集中在土壤中的優(yōu)勢(shì)菌鏈霉菌上.對(duì)這一類群菌的廣泛篩選, 的確發(fā)現(xiàn)了很多新種,而且它們能產(chǎn)生多種有用次生代謝產(chǎn)物.然而,隨著大量生物活性物質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn),從鏈霉菌得到新的生物活性物質(zhì)的幾率逐漸下降.同時(shí),另一類菌——稀有放線菌逐漸引起了新藥開(kāi)發(fā)研究者們的注意.
本文主要從分離培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)角度,介紹了幾種主要的且能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的稀有放線菌高選擇性分離方法.根據(jù)目的菌對(duì)各種條件的耐受范圍和有利于它們生長(zhǎng)的條件,選擇和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的成分、 酸堿度等.
1 從沙漠土樣選擇性分離稀有放線菌培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)
葡萄糖—天門冬酰胺改良培養(yǎng)基、淀粉—甘油培養(yǎng)基和甘油—酪素培養(yǎng)基成分均能促進(jìn)稀有放線菌的生長(zhǎng).分離培養(yǎng)基中加入4種抗生素抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng),有利于稀有放線菌分離.
分離程序如下:沙漠土樣用溶液稀釋,溶液組成為:K2HPO4 0.38％ , KH2PO4 0.12％ , MgSO4·7H2O 0.51 ％ ,NaCl 0.25％, Fe2 (SO4 )3·7 H2O 0.005％ , MnSO4 0.005％.
選用3種分離培養(yǎng)基,分別是:
葡萄糖一天門冬酰胺改良培養(yǎng)基:葡萄糖 1 ％, 天門冬酰胺 0.1 ％, K2HPO4 0.1%, FeSO4·7H2O 0.0001％, MnC12·4 H2O 0.0001％, ZnSO4·7H2O 0.001％, 瓊 脂1.5％ , pH7.0；
淀粉一甘油培養(yǎng)基 :淀粉 1.0％, 甘油1.0％ ,(NH4)2SO4 0.2 ％, CaCO3 0.2％ , KH2PO4 0.1％, MgSO4·7 H2O 0.1 ％ , NaC1 0.1 ％, 脯氨酸 l ％ , 瓊脂1.2％ ,pH7.0；
甘油 一酪素培養(yǎng)基 :甘油 1.0％, 酪素0.03％ ,KNO3 0.2％ , NaC1 0.2％ , K2HPO4 0.2％ , MgSO4·7 H2O 0.005％ , FeSO4·7 H2O 0.001％, CaCO3 0.02％ , 瓊脂1.8％ , pH7.0.
制霉菌素12.5m 克/毫升, 苯菌靈 20m克/毫升 , 環(huán)絲氨酸 50m克/毫升, 萘啶酸25 mg /ml均加入3種分離培養(yǎng)基.稀釋涂布平板法分離,37培養(yǎng) ,7 d.
2 吉蘭糖膠系列分離培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)
吉蘭糖膠是一種由Pseudomonas elodea產(chǎn)生的多糖.常用作植物組織培養(yǎng)的凝固基質(zhì), 有促進(jìn)植物細(xì)胞生長(zhǎng)的作用.它也能促進(jìn)很多放線菌氣生菌絲的生長(zhǎng)及氣生孢子的形成 , 如Sporichthya ,Actinobispora ,Planobispora, Plano—monospora等.因此,可以用作稀有放線菌分離培養(yǎng)基的凝固基質(zhì).
通常分離產(chǎn)動(dòng)孢的游動(dòng)放線菌, 如Planobispora ,Planomonospora等, 利用它們孢子的游動(dòng)性, 可用誘餌捕集法、化學(xué)趨化法和離心法,如Nonomura等人用花粉或角蛋白誘餌捕集法成功地分離得到Actinoplanesspp., Pilimelia和Planomonospora spp .； 化學(xué)趨化法選擇性分離Actinoplanes ,Catenuloplanes和Dactylosporangium ； 離心法將動(dòng)孢菌與鏈霉菌等不產(chǎn)動(dòng)孢的放線菌分開(kāi), 選擇性分離稀有產(chǎn)動(dòng)孢的放線菌.Suzuki介紹了一些利用吉蘭糖膠特異性分離此類放線菌的方
2.1 選擇性分離 Sporichthya Sporichthya polymorpha在查氏瓊脂上形成的菌落小,難以辨別.而在HV吉蘭糖膠上形成的菌落大,便于快速鑒定.同樣,Sporichthya在幾丁質(zhì)瓊脂(Colloidal chitin agar )、放線菌分離瓊脂(Actinomyceteisolation agar)、蛋清瓊脂 (Egg a lbuminagar)和 HV瓊脂上形成的氣生菌絲都不及HV吉蘭糖膠豐富.實(shí)驗(yàn)研究表明,Ca2+促進(jìn)Sporichthya polymorpha 生長(zhǎng).Ca2+加入HV吉蘭糖膠以提高對(duì)Sporichthya的選擇性.
Suzuki等用脫脂牛奶對(duì)土樣進(jìn)行預(yù)處理,可刺激Spofichthya孢子的運(yùn)動(dòng).需要引起注意的是,高溫能夠破壞脫脂牛奶中的刺激因子,所以脫脂牛奶不能進(jìn)行高溫滅菌.pH8.0時(shí), 孢子運(yùn)動(dòng)頻率最大.嗎啉丙磺酸(MOPS, pH8.0)有助于 Sporichthya孢子的運(yùn)動(dòng),提高了分離效率.差速離心是分離動(dòng)孢菌的有效分離方法之一.脫脂牛奶結(jié)合離心法提高了分離的選擇性.分離程序如下:將風(fēng)干土樣在80干熱處理,l h , 用含0.1％脫脂牛奶 (未滅菌) 的MOPS(morpholinepropanesulfonic acid,pH8.0) 浸液制成土壤懸液,27振蕩培養(yǎng) 1 h ,離心1000 r/min ,10 min,用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋后, 涂布HVG平板( CaC12 2mM, 放線酮50μ克/毫升) , 27培養(yǎng),21至28d.
2.2 選擇性分離 Planobispora Planobispora通常形成棒狀孢囊,孢囊內(nèi)包含一對(duì)縱生的孢子.這是Planobispora 典型的形態(tài)特征.Planobispora在一些標(biāo)準(zhǔn)分離培養(yǎng)基,如淀粉一硝酸鹽酪素瓊脂、 放線菌分離瓊脂和蛋清瓊脂上不能或稀疏形成孢囊.相比之下,在HSG上能夠產(chǎn)生豐富的孢囊.有意思的是,當(dāng)Planobom菌落數(shù)超50個(gè)時(shí),在吉蘭糖膠培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生豐富的孢囊,而菌落數(shù)少于20個(gè)時(shí), 在氣絲上不能形成孢囊.
HSG即腐殖酸微量鹽吉蘭糖膠.其中微量鹽包括FeSO4·7H2O,MnCl2·4H2O,ZnSO4·7H2 O,NiSO4·6 H2O.它們?cè)诘蜐舛惹闆r下,可以促進(jìn)孢囊的形成.在高濃度條件下,卻抑制孢囊的形成.堿性條件增加了有機(jī)物質(zhì)的降解,利于產(chǎn)孢囊的動(dòng)孢菌生長(zhǎng).pH 9.0比中性pH更利于Planobispora孢囊的形成.同時(shí),堿性條件也可以抑制優(yōu)勢(shì)菌鏈霉菌的生長(zhǎng),提高對(duì)Planobispora的分離效果.當(dāng)培養(yǎng)溫度為 32至37時(shí),不利于非目的菌的生長(zhǎng),而對(duì)Planobispora的生長(zhǎng)卻不構(gòu)成影響.Suzuki等采用32培養(yǎng),以減少水分的蒸發(fā), 同樣達(dá)到選擇性分離的效果.
分離程序如下:風(fēng)干土樣在90干熱處理,1h , 用CHES(5mM pH9.0),脫脂牛奶0.1％ , 吐溫80 0.01％, 三甲氧芐二氨嘧啶 100μ克/毫升和萘啶酸100μ克/毫升 制成土壤懸液 ,35振蕩l h ,離心1000g,10min ,用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋后,涂布HSG平板(三甲氧芐二氨嘧啶50g/毫升,萘啶酸50μ克/毫升 ,依諾沙星20μ克/毫升 ,氨芐青霉素鈉鹽2克/毫升,硫酸鏈霉素1克/毫升,放線酮50μ克/毫升,制霉菌素5 0μ克/毫升 ,pH 9.0) ,32培養(yǎng),14至21d.
2.3選擇性分離 Planomonospora Planomonospora在一些分離培養(yǎng)基,如淀粉—硝酸鹽酪素瓊脂、 放線菌分離瓊脂和蛋清瓊脂,不能形成特征性孢囊.而在HSG上能夠產(chǎn)生豐富的孢囊.雖然在 HVA上, Planomonospora 也形成孢囊,但與HSG相比,稀疏得多.分離培養(yǎng)基的堿性環(huán)境利于Planomonospora孢囊的形成.CHES(pH 9.0)和 0.1 ％脫脂牛奶對(duì)動(dòng)孢菌的分離效果得到進(jìn)一步的驗(yàn)證.
分離程序如下:風(fēng)干土樣在100干熱處理, 1 h ,用CHES(5 mM pH 9.0)和0.1％脫脂牛奶制成土壤懸液,32 振蕩90 mi n , 離心1000 g,10 min, 32再培養(yǎng),1 h , 涂布 HSG平板(三甲氧芐二氨嘧啶20μ克/毫升,萘啶酸20μ克/毫升, 依諾沙星20μ克/毫升,氨芐青霉素鈉鹽2克/毫升,放線酮50μ克/毫升,制霉菌素50μg/mE ),35培養(yǎng),14-21d.
2.4選擇性分離 Actinomadura rugatobispora Actinomadura rugatobispora形成綠色的氣生菌絲,并在氣生菌絲上產(chǎn)生豐富的縱向排列的成對(duì)孢子,孢子表面多皺,有脊. A.rugatobispora容易從形態(tài)特征進(jìn)行鑒別.在一些分離培養(yǎng)基上,如淀粉—硝酸鹽酪素瓊 脂、 放線菌分離瓊脂和蛋清瓊脂,A.rugatobispora不產(chǎn)生孢子.在HVA上,部分菌株當(dāng)平板上菌落數(shù)只有5至20個(gè)時(shí),產(chǎn)生稀疏的孢子.而在 HMG上,都能產(chǎn)生豐富的孢子.
HMG即HVG中另外加入1g/L嗎啉丙磺酸( MOPS),維持培養(yǎng)基pH8.0,利于A.rugatobispora的生長(zhǎng).分離培養(yǎng)基中加入硫酸慶大霉素和氨芐青霉素鈉鹽,用于抑制鏈霉菌等非目的菌的生長(zhǎng).
分離程序如下:風(fēng)干土樣在120干熱處理,l h ,用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋制成土壤懸液,涂布平板( HMG,硫酸慶大霉素100 克/毫升, 氨芐青霉素鈉鹽20克/毫升 ,三甲氧芐二氨嘧啶50μ克/毫升, 萘啶酸10μ克/毫升,放線酮50μ克/毫升 , 制霉菌素 50μ克/毫升), 35培養(yǎng),2l至28 d.
3 結(jié)束語(yǔ)
一些學(xué)者用熒光顯微鏡、電子顯微鏡直接觀察活體,或使用DNA探針等方法來(lái)檢測(cè)自然界的活菌體,到目前為止 ,一百多年來(lái)人們只分離到自然界實(shí)有放線菌的10％至20％(有人甚至估計(jì)為0.1％至1％到 10％.換言之,由于技術(shù)手段等限制因素,自然界實(shí)際存在的未知放線菌至少還有80％~90％未分離得到純培養(yǎng),應(yīng)進(jìn)一步深入研究,設(shè)計(jì)出優(yōu)良的分離培養(yǎng)基,以期得到更多的稀有放線菌新種.