化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法金黃色葡萄球菌
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
國(guó)產(chǎn)/一次性無菌培養(yǎng)皿測(cè)五指用
化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法金黃色葡萄球菌
金黃色葡萄球菌在外界分布較廣,抵抗力也較強(qiáng),能引起人體局部化膿性病灶,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥,因此化妝品中檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌有重要意義.
方法提要
根據(jù)本菌特有的形態(tài)及培養(yǎng)特性,應(yīng)用BairdParker平板進(jìn)行分離,該平板中的氯化鋰可抑制革蘭
氏陰性細(xì)菌生長(zhǎng),丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長(zhǎng),以提高檢出率,并利用分解甘露醇和血漿凝固
酶等特征.以茲鑒別.
培養(yǎng)基和試劑
培養(yǎng)基
SCDLP液體培養(yǎng)基
見克B7918.1-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法總則》.
7.5%的氯化鈉肉湯
成分:
蛋白胨10克,牛肉膏3克,氯化鈉75克,蒸餾水1000毫升
制法:將上述成分加熱溶解,調(diào)pH為7.4,分裝,121攝氏度(151b)15分鐘高壓滅菌.
BairdParker平板
成分:胰蛋白胨10克,牛肉膏5克,酵母浸膏1克,丙酮酸鈉10克,甘氨酸12克,氯化鋰(LiCl.6H,0)5克,瓊脂20克,蒸餾水950毫升,pH7.0士0.2
增菌劑的配制:30%卵黃鹽水50毫升與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10毫升混合,保存于冰箱內(nèi).制法:將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸完全溶解,冷至25C校正pH.分裝每瓶95毫升,121攝氏度高壓滅15分鐘.臨用時(shí)加熱溶化瓊脂,每95毫升加入預(yù)熱至50攝氏度的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5毫升,搖勻后傾注平板.培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的.使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過48h.
血瓊脂培養(yǎng)基
成分:營(yíng)養(yǎng)瓊脂100毫升,脫纖維羊血(或兔血)10毫升
制法:將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱溶化,待冷至50攝氏度左右以無菌手續(xù)加入脫纖維羊血,搖勻,制成平板,置冰箱內(nèi)備用.
甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基
成分:蛋白胨10克,氯化鈉5克,甘露醇10克,牛肉膏5克,0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12毫升,蒸餾水1000毫升
制法:將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中,加熱溶解,諞pH7.4,加入甘露醇和指示劑,混勻后分裝試管中,115C(10Ib)20分鐘滅菌備用.
兔(人)血漿制備
取3.8%檸檬酸鈉溶液[121C(15lb)30分鐘滅菌]1份加兔(人)全血4份,混勻靜置,2000~3000r/分鐘離心3~5分鐘.血球下沉,取上面血漿.
設(shè)備和材料
顯微鏡,培養(yǎng)箱,離心機(jī),滅菌吸管:1毫升,5毫升,10毫升,滅菌試管,載玻片,酒精燈.
操作步驟
增菌:取1;10稀釋的樣品10毫升接種到90m!SCDLP液體培養(yǎng)基中(如無此培養(yǎng)基也可用7.5%氯化鈉肉湯),置37C培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24h.
注:如無此培養(yǎng)基也可用7.5%氯化鈉肉湯,檢驗(yàn)含防腐劑的化妝品時(shí),可在1000毫升此培養(yǎng)基中加1克卵磷脂、7克吐溫80.分離:自上述增菌培養(yǎng)液中,取1~2接種環(huán),劃線接種在BairdParker氏培養(yǎng)基,如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板,置37攝氏度培養(yǎng)24~48h.在血瓊脂平板上菌落呈金黃色,大而突起,圓形,不透明,表面光滑,周圍有溶血圈.在BairdParker氏培養(yǎng)基上為圓形,光滑,凸起,濕潤(rùn),直徑為2~3毫米,顏色呈灰色到黑色,邊緣為淡色,周圍為--混濁帶,在其外層有--透明帶.用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度.偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落,但無混濁帶及透明帶.挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳?置37攝氏度培養(yǎng)24h.染色鏡檢:挑取分純菌落,涂片,進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢.金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,排列成葡萄狀,無芽胞,無夾膜,致病性葡萄球菌,菌體較小,直徑約為0.5~lμm.甘露醇發(fā)酵試驗(yàn):取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中,置37攝氏度培養(yǎng)24h,金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸.
血漿凝固酶試驗(yàn)
玻片法:取清潔千燥載玻片,一端滴加一-滴滅菌生理鹽水,另一端滴加一滴血漿,用接種環(huán)挑取待檢菌落,分別在生理鹽水及血漿中充分研磨混合.血漿與菌苔混懸液在5分鐘內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊時(shí),而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固現(xiàn)象者為陽性,如兩者均無凝固現(xiàn)象則為陰性.凡玻片試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)或鹽水滴與血漿滴均有凝固現(xiàn)象,再進(jìn)行試管凝固酶試驗(yàn).試管法:吸取1;4新鮮血漿0.5毫升,放入滅菌小試管中,再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5毫升.混勻,放37攝氏度溫箱或水浴中,每半小時(shí)觀察一次,24h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性.同時(shí)以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5毫升,分別加入滅菌小試管內(nèi)0.5毫升1:4血漿混勻,做為對(duì)照.
檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告
凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長(zhǎng),經(jīng)染色鏡檢,證明為革蘭氏陽性葡萄球菌,并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸.血漿凝固酶試驗(yàn)陽性者,可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌.
附加說明:
本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)所歸口.本標(biāo)準(zhǔn)由“化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法”起草小組起草.本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人劉以賢.本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)所負(fù)責(zé)解釋.