化妝品微生物標準檢驗方法糞大腸菌群
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
官網(wǎng)培養(yǎng)基國內(nèi)微生物培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家
化妝品微生物標準檢驗方法糞大腸菌群
糞大腸菌群細菌來源于人和溫血動物的糞便.檢出糞大腸菌群表明該化妝品已被糞便污染，有可能存在其他腸道致病菌或寄生蟲等病原體的危險.因此糞大腸菌被列為重要的衛(wèi)生指標菌
方法提要
根據(jù)糞大腸菌群所具有的生物特性，如革蘭氏陰性無芽胞桿菌在44C培養(yǎng)24~48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣,能在選撣性培養(yǎng)基上產(chǎn)生典型菌落,能分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)
成分:蛋白胨20克,豬膽鹽5克,乳糖5克,0.4%溴甲酚紫水溶液2.5毫升,蒸餾水1000毫升
制法:將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于蒸餾水中,調(diào)pH到7.4,加入指示劑，混勻,分裝試管(每支試管中加一個小倒管).115攝氏度(10lb)20分鐘滅菌
雙倍濃度乳糖膽鹽培養(yǎng)基
按上述乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分,蒸餾水量不變,其他成分量加倍
伊紅美藍(EMB)瓊脂
成分:蛋白胨10克,乳糖10克,磷酸氫二鉀2克,瓊脂20克,2%伊紅水溶液20毫升,0.5%美藍水溶液13毫升,蒸餾水1000毫升
制法:先將瓊脂加到900毫升蒸餾水中,加熱溶解,然后加入磷酸氫二鉀蛋白胨,混勻，使之溶解.再以蒸餾水補足至1000毫升.校正pH值為7.2~7.4,分裝于燒瓶內(nèi),121C(151b)15分鐘高壓滅菌備用.臨用時加入乳糖并加熱融化瓊脂.冷至60C左右以無菌手續(xù)加入滅菌的伊紅美藍溶液，搖勻.傾注平皿備用
蛋白胨水(作靛基質(zhì)試驗用)
成分:蛋白胨(或胰蛋白胨)20克,氯化鈉5克,蒸餾水1000毫升
制法:將上述成分加熱熔化,調(diào)pH值為7.0~7.2,分裝小試管,高壓滅菌121C(151b)15分鐘
靛基質(zhì)試劑
柯凡克試劑:將5克對二甲氨基苯甲醛溶解于75毫升戊醉中,然后綬慢加入濃鹽酸25毫升
試驗方法:接種細菌于蛋白胨水中，于44C培養(yǎng)24h.沿管壁加柯凡克試劑0.3~0.5毫升,輕搖試管.陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色
注:蛋白胨應含有豐富的色氨酸,每批蛋白胨買來后,應先用已知菌種鑒定后方可使用
革蘭氏染色法
染液制備
結(jié)晶紫染色液:
結(jié)晶紫1克,95%酒精20毫升,1%草酸銨水溶液80毫升
將結(jié)晶紫溶于酒精中,然后與草酸銨溶液混合
革蘭氏碘液:
碘1克,碘化鉀2克,蒸餾水300毫升
將碘與碘化鉀先進行混合,加入蒸餾水少許,充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300毫升
脫色液:95%乙醇
復染液:
沙黃復染液:
沙黃0.25克,95%酒精10毫升,蒸餾水90毫升
將沙黃溶解于酒精中,然后用蒸餾水稀釋
稀石碳酸復紅液:稱取堿性復紅10克,研細，加95%乙醇100毫升,放置過夜，濾紙過濾.取該液10毫升,加5%石碳酸水溶液90毫升混合,即為石碳酸復紅液.再取此液10毫升加水90毫升,即為稀石碳酸復紅液
染色法
將涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染色液,染1分鐘,水洗
滴加革蘭氏碘液,作用1分鐘,水洗
滴加95%酒精脫色,約30秒,或?qū)⒕凭螡M整個涂片,立即傾去,再用酒精滴滿整個涂片,脫色10秒,水洗
滴加復染液,復染1分鐘,水洗,待干,鏡檢
染色結(jié)果
革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色
注:如用1;10稀釋石碳酸復紅染色液作復染液.復染時間僅需10秒
儀器
恒溫水浴或隔水式恒溫箱:44C,溫度計,顯微鏡,載玻片,接種環(huán),電爐,錐形瓶,試管,小倒管,p小時計或p小時試紙,高壓消毒鍋,滅菌吸管,滅菌平皿
操作步驟
取10毫升1;10稀釋的樣品,加到10毫升雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中,置44攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48小時,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣,則報告為糞大腸菌群陰性
如產(chǎn)酸產(chǎn)氣,劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上,置37攝氏度培養(yǎng)18~24小時.同時取該培養(yǎng)液1~2滴接種到蛋白胨水中,置44C培養(yǎng)24小時
經(jīng)培養(yǎng)后,在上述平板,上觀察有無典型菌落生長.大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色,圓形,邊緣整齊,表面光滑濕潤,常具有金屬光澤.也有的呈紫黑色,不帶或略帶金屬光澤,或粉紫色,中心較深的菌落.亦常為大腸菌群,均應注意挑選
挑取上述可疑菌落,涂片作革蘭氏染色鏡檢
在蛋白胨水培養(yǎng)液中,加入靛基質(zhì)試劑約0.5毫升,觀察靛基質(zhì)反應.陽性者液面呈玫瑰紅色;陰性反應液面呈試劑本色
檢驗結(jié)果報告
平板上有典型菌落,并經(jīng)證實為革蘭氏陰性短桿菌,靛基質(zhì)試驗陽性,則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群
附加說明:
本標準由中國預防醫(yī)學科學院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所歸口
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草
本標準主要起草人周淑玉
本標準由中國預防醫(yī)學科學院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所負責解釋