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細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢驗(yàn)方法

發(fā)布時(shí)間：

2022-12-27

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細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢驗(yàn)方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量應(yīng)符合表 1 所示的技術(shù)要求。

表 1 技術(shù)要求

二、檢驗(yàn)方法

除非另有說(shuō)明，檢驗(yàn)中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和中華人民共和國(guó)藥典 2010年版中規(guī)定的純化水。

2.1澄清度的測(cè)定

稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于 1 000ml 燒杯中，加水 950ml，攪拌至溶解，補(bǔ)加水至 1000ml, 攪

拌均勻。按中華人民共和國(guó)藥典 2010 年版二部附錄Ⅸ B 進(jìn)行。

2.2pH 值的測(cè)定

稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于 1 000ml 燒杯中，加水 950ml ，攪拌至溶解，補(bǔ)加水至 1000ml, 攪拌均勻。按中華人民共和國(guó)藥典 2010 年版三部附錄Ⅴ A 進(jìn)行。

2.3干燥減量的測(cè)定

按中華人民共和國(guó)藥典 2010 年版三部附錄Ⅶ L 干燥失重測(cè)定法進(jìn)行。

2.4滲透壓的測(cè)定

稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于 1 000ml 燒杯中，加水 950ml ，攪拌至溶解，補(bǔ)加水至 1000ml, 攪拌均勻。按中華人民共和國(guó)藥典 2010 年版三部附錄Ⅴ H滲透壓摩爾濃度測(cè)定法進(jìn)行。

取兩次平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果，兩次平行測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值的 5%。

2.5細(xì)菌內(nèi)毒素的測(cè)定

按中華人民共和國(guó)藥典 2010 年版三部附錄Ⅻ E 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行。

2.6微生物限度的測(cè)定

按中華人民共和國(guó)藥典 2010年三部附錄Ⅻ G微生物限度檢查法進(jìn)行，檢查項(xiàng)目為細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。

2.7細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)

2.7.1貼壁型細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)

2.7.1.1方法提要

1)本試驗(yàn)所用容器具及溶液均為無(wú)菌，試驗(yàn)操作過(guò)程均為無(wú)菌操作。

2)細(xì)胞在 37℃恒溫條件下，在含體積分?jǐn)?shù) 3%或 10%的小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng) 72h，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；細(xì)胞生長(zhǎng) 72h 后，更換不含小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 48h，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.7.1.2試劑和材料

1)牛血清：符合中華人民共和國(guó)藥典 2010 年版三部附錄ⅩⅢ D。

2)平衡鹽溶液：稱取氯化鉀 0.2g ，精確至 0.01g ；無(wú)水磷酸二氫鉀 0.2g ，精確至 0.01g ；氯化鈉 8.0g ，精確至 0.01g ；無(wú)水磷酸氫二鈉 1.15g ，精確至 0.001g ；加純化水 1 000ml ，混勻，測(cè) pH 值， pH 值應(yīng)在

7.5 ± 0.3 ，過(guò)濾除菌即得。

3)細(xì)胞： vero 細(xì)胞（或根據(jù)不同的細(xì)胞培養(yǎng)基種類選擇適應(yīng)的細(xì)胞 ): 細(xì)胞代次不超過(guò) 150 代。

4)細(xì)胞培養(yǎng)液：按產(chǎn)品使用說(shuō)明書要求配制；

3) 胰蛋白酶溶液：稱取胰蛋白酶（ 1:250 ） 2.5g ，精確至 0.01g ，加 1 000ml 平衡鹽溶液，混勻、測(cè)

pH 值，用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 調(diào) pH 值 7.6 ～ 7.8 ，過(guò)濾除菌即得。

2.7.1.3儀器

1）醫(yī)用凈化工作臺(tái)：潔凈級(jí)別為百級(jí) .

2）二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱：能通二氧化碳?xì)怏w并且保持二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為（5±0.1 ）％，能在（37±1）℃恒溫。

3）細(xì)胞培養(yǎng)瓶： T25 型、無(wú)菌。

4）顯微鏡：倒置、相差。

5）血球計(jì)數(shù)板。

6）蓋玻片：無(wú)水乙醇浸泡并擦干。

2.7.1.4試驗(yàn)步驟

1）制備細(xì)胞懸液

A 取長(zhǎng)成致密單層的細(xì)胞種子，將原細(xì)胞培養(yǎng)液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)吸出，用適量平衡鹽溶液洗細(xì)胞一次，棄洗液（去除死細(xì)胞）。

B 向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶溶液 1ml ，消化一定時(shí)間，在顯微鏡下觀察 , 當(dāng)細(xì)胞變圓接近脫壁時(shí)，將胰蛋白酶溶液倒掉。

C 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入一定量細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打，使細(xì)胞脫壁制成細(xì)胞懸液 A。

2)細(xì)胞培養(yǎng)

A 吸取一定量的細(xì)胞懸液 A，加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

B 向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加至 10ml 含體積分?jǐn)?shù)為 3%或 10%的小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，使細(xì)胞接種數(shù)量為 5

× 10 細(xì)胞 /ml 。

C 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶送入培養(yǎng)箱，在（ 37±1）℃溫度條件及（ 5±0.1 ）％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

D 培養(yǎng) 72h，觀察細(xì)胞形態(tài)，按照 2.7.1.4 步驟 1）方法制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

E 培養(yǎng) 72h后，更換不含牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液 10ml ，繼續(xù)培養(yǎng) 48h，觀察細(xì)胞形態(tài)，按照 2.7.1.4 試驗(yàn)步驟 1）方法制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3)細(xì)胞計(jì)數(shù)

A將需要計(jì)數(shù)的細(xì)胞按按照 2.7.1.4 步驟 1）方法制備細(xì)胞懸液 B。

B吸取細(xì)胞懸液 B100μ l 轉(zhuǎn)移至離心管中，視細(xì)胞量確定是否稀釋及稀釋倍數(shù)。

C 將蓋玻片蓋于計(jì)數(shù)板中心的計(jì)數(shù)室上方。調(diào)整計(jì)數(shù)板中的細(xì)胞數(shù)量在（ 100～ 300）個(gè)。沿蓋玻片邊緣點(diǎn)加細(xì)胞懸液使其通過(guò)毛細(xì)作用自然滲入，不要留有氣泡，不要外溢，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

D 觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞壓中線時(shí)，一般遵循“計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下”的原則。將計(jì)數(shù)板觀察細(xì)胞數(shù)代入下列公式：

計(jì)數(shù)板觀察細(xì)胞數(shù)× 10 ×稀釋倍數(shù) /4 ＝細(xì)胞數(shù) /ml

2.7.1.5 分析結(jié)果的表述

培養(yǎng) 72h的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)應(yīng)正常，活細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到 1×10

5 個(gè)/ml 以上。繼續(xù)維持培養(yǎng) 48h的細(xì)胞形態(tài)

應(yīng)正常，活細(xì)胞數(shù)量應(yīng)不小于 1×10

5 個(gè)/ml 以上。

2.7.2 懸浮型細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)

2.7.2.1 方法提要

本試驗(yàn)所用容器具及溶液均為無(wú)菌，試驗(yàn)操作過(guò)程均為無(wú)菌操作。

細(xì)胞在 37℃恒溫條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng) 72h，觀察細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行 72h細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.7.2.2 試劑和材料