微生物技術(shù)革蘭氏染色法

發(fā)布時間：

2022-12-27

作者：

微生物技術(shù)革蘭氏染色法

一目的要求

了解革蘭氏染色的原理,學(xué)習并掌握革蘭氏染色的方法.

二基本原理

革蘭氏染色反應(yīng)是細菌分類和鑒定的重要性狀.它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的.革蘭氏染色法(Gramstain)不僅能觀察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類:染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌,用G+表示;染色反應(yīng)呈紅色(復(fù)染顏色)的稱為革蘭氏陰性細菌,用G-表示.

細菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng),是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的.革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的,在染色過程中,當用乙醇處理時,由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小,通透性降低,使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細胞內(nèi)而不易脫色,因此,呈現(xiàn)藍紫色;革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低,而脂類物質(zhì)含量高,當用乙醇處理時,脂類物質(zhì)溶解,細胞壁的通透性增加,使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色,然后又被染上了復(fù)染液(番紅)的顏色,因此呈現(xiàn)紅色.

革蘭氏染色需用四種不同的溶液:堿性染料(basicdye)初染液;媒染劑(mordant);脫色劑(decolorisingagent)和復(fù)染液(counterstain).堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣,而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫(crystalviolet).媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力,即以某種方式幫助染料固定在細胞上,使不易脫落,碘(iodine)是常用的媒染劑.脫色劑是將被染色的細胞進行脫色,不同類型的細胞脫色反應(yīng)不同,有的能被脫色,有的則不能,脫色劑常用95％的酒精(ethanol).復(fù)染液也是一種堿性染料,其顏色不同于初染液,復(fù)染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色,而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色,從而將細胞區(qū)分成G+和G-兩大類群,常用的復(fù)染液是番紅.

三器材

大腸桿菌,枯草芽孢桿菌;

革蘭氏染色液,載玻片,顯微鏡等.

四操作步驟

1．涂片將培養(yǎng)14至16小時的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24小時的大腸桿菌分別作涂片(注意涂片切不可過于濃厚),干燥固定.固定時通過火焰1至2次即可,不可過熱,以載玻片不燙手為宜.

2．染色

(1)初染加草酸銨結(jié)晶紫一滴,約一分鐘,水洗.

(2)媒染滴加碘液沖去殘水,并覆蓋約一分鐘,水洗.

(3)脫色將載玻片上面的水甩凈,并襯以白背景,用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止,約20至30秒鐘,立即用水沖凈酒精.

(4)復(fù)染用番紅液染1至2分鐘,水洗.

(5)鏡檢干燥后,置油鏡觀察.革蘭氏陰性菌呈紅色,革蘭氏陽性菌呈紫色.以分散開的細菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準,過于密集的細菌,常常呈假陽性.

(6)同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片,作革蘭氏染色對比.