微生物實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的單染色法
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
中國藥典國標(biāo)培養(yǎng)基
細(xì)菌的單染色法
一,目的要求
1學(xué)習(xí)微生物涂片,染色的基本技術(shù),掌握細(xì)菌的單染色方法及無菌操作技術(shù).2鞏固顯微鏡的使用方法.
二,基本原理
所謂單染色法是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法.此法操作簡便,適用于菌體一般形態(tài)的觀察.
在中性,堿性或弱酸性溶液中,細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷,所以常用堿性染料進(jìn)行染色.堿性染料并不是堿,和其他染料一樣是一種鹽,電離時染料離子帶正電,易與帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色.例如,美藍(lán)(亞甲藍(lán))實(shí)際上是氯化亞甲藍(lán)鹽(methylenebluechloride,縮寫為MBC),它可被電離成正,負(fù)離子：
MBC→methyleneblue++chloride-
帶正電荷的染料離子可使細(xì)菌細(xì)胞染成藍(lán)色.常用的堿性染料除美藍(lán)外,還有結(jié)晶紫(crystalviolet),堿性復(fù)紅(basicfu-chsin),番紅(又稱沙黃,safranine)等.
細(xì)菌體積小,較透明,如未經(jīng)染色常不易識別,而經(jīng)著色后,與背景形成鮮明的對比,使易于在顯微鏡下進(jìn)行觀察.
三,器材
顯微鏡,酒精燈,載玻片,接種環(huán),雙層瓶,擦鏡紙,生理鹽水；
呂氏堿性美藍(lán)染色液,石炭酸復(fù)紅染色液；
金黃色葡萄球菌,枯草芽孢桿菌.
四,操作步驟
1.涂片取兩塊干凈的載玻片,各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央,用無菌操作(圖Ⅳ-1,具體操作參照實(shí)驗(yàn)一),分別挑取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌于二載玻片的水滴中(每一種菌制一片),調(diào)勻并涂成薄膜.注意滴生理鹽水時不宜過多,涂片必須均勻.
2.干燥于室溫中自然干燥.
3.固定涂片面向上,于火焰上通過2-3次,使細(xì)胞質(zhì)凝固,以固定細(xì)菌的形態(tài),并使其不易脫落.但不能在火焰上烤,否則細(xì)菌形態(tài)將毀壞.
4.染色放標(biāo)本于水平位置,滴加染色液于涂片薄膜上,染色時間長短隨不同染色液而定.呂氏堿性美藍(lán)染色液約染2-3分鐘,石炭酸復(fù)紅染色液約染1-2分鐘.
5.水洗染色時間到后,用自來水沖洗,直至沖下之水無色時為止.注意沖洗水流不宜過急,過大,水由玻片上端流下,避免直接沖在涂片處.沖洗后,將標(biāo)本晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干,待完全干燥后才可置油鏡下觀察.
6.鏡檢
按實(shí)驗(yàn)二操作程序進(jìn)行顯微鏡觀察.
五,實(shí)驗(yàn)報告
1.結(jié)果
繪出你所觀察到的經(jīng)單染色的兩種細(xì)菌形態(tài)圖.
2.思考題
(1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會,你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時,應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？
(2)制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？
呂氏(Loeffler)堿性美藍(lán)染液
A液：美藍(lán)(methyleneblue)0.6g
95%酒精30ml
B液：KOH0.01g
蒸餾水100ml
分別配制A液和B液,配好后混合即可.
齊氏(Ziehl)石炭酸復(fù)紅染色液
A液：堿性復(fù)紅(basicfuchsin)0.3g
95%酒精10ml
B液：石炭酸5.0g
蒸餾水95ml
將堿性復(fù)紅在研缽中研磨后,逐漸加入95%酒精,繼續(xù)研磨使其溶解,配成A液.
將石炭酸溶解于水中,配成B液.
混合A液及B液即成.通?？蓪⒋嘶旌弦合♂?-10倍使用,稀釋液易變質(zhì)失效,一次不宜多配.