菌種保藏技術(shù):真空冷凍干燥法

發(fā)布時(shí)間：

2022-12-27

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菌種保藏技術(shù):真空冷凍干燥法

將微生物冷凍,在減壓下利用升華作用除去水分,使細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止,從而長期維持存活狀態(tài).

操作步驟如下：

好氧菌冷凍干燥管的制備

步驟1:安瓿管準(zhǔn)備

安瓿管材料以中性玻璃為宜.清洗安瓿管時(shí),先用2%鹽酸浸泡過夜,自來水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標(biāo)簽,標(biāo)上菌號及時(shí)間,加入脫脂棉塞后,121下高壓滅菌15-20分鐘,備用.

步驟2:保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備

保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇.配制保護(hù)劑時(shí),應(yīng)注意其濃度及pH值,以及滅菌方法.如血清,可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂,用離心方法去除上層油脂,一般在100間歇煮沸2-3次,每次10-30分鐘,備用.

步驟3:凍干樣品的準(zhǔn)備

在最適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期,進(jìn)行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程》(試行)),與保護(hù)劑混合均勻,分裝.微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/毫升為宜(以大腸桿菌為例,為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升瓊脂斜面兩支).采用較長的毛細(xì)滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要濺污上部管壁,每管分裝量約0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,裝量為半個(gè)球部.若是液體培養(yǎng)的微生物,應(yīng)離心去除培養(yǎng)基,然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻,再分裝于安瓿管中.分裝安瓿管時(shí)間盡量要短,最好在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍.分裝時(shí)應(yīng)注意在無菌條件下操作.

步驟4:預(yù)凍

一般預(yù)凍2小時(shí)以上,溫度達(dá)到-20到-35左右.

步驟5:冷凍干燥

采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥.

將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi),開始冷凍干燥,時(shí)間一般為8-20小時(shí).

步驟6:真空封口及真空檢驗(yàn)

將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì),然后采用真空泵抽真空,在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封.

熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度.

步驟7:保藏

安瓿管應(yīng)低溫避光保藏.

步驟8:質(zhì)量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查,如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等.