多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
賣倒好的固體培養(yǎng)基廠家
多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群
一,目的要求
1.學習測定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法.
2.了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性.
二,基本原理
多管發(fā)酵法包括初(步)發(fā)酵試驗,平板分離和復發(fā)酵試驗三個部分.
1.初(步)發(fā)酵試驗
發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基,并倒置一德漢氏小套管.乳糖能起選擇作用,因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖,而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產酸產氣.為便于觀察細菌的產酸情況,培養(yǎng)基內加有溴甲酚紫作為pH指示劑,細菌產酸后,培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色.溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽胞菌生長的作用.
水樣接種于發(fā)酵管內,37攝氏度下培養(yǎng),24小時內小套管中有氣體形成,并且培養(yǎng)基混濁,顏色改變,說明水中存在大腸菌群,為陽性結果,但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產氣；此外產酸不產氣的也不能完全說明是陰性結果.在量少的情況下,也可能延遲到48小時后才產氣,此時應視為可疑結果,因此,以上兩種結果均需繼續(xù)做下面兩部分實驗,才能確定是否是大腸菌群.48小時后仍不產氣的為陰性結果.
2.平板分離
平板培養(yǎng)基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂(遠藤氏培養(yǎng)基,Endo＇s medium)或伊紅美藍瓊脂(eosin methylene blueagar,EMB agar),前者含有堿性復紅染料,在此作為指示劑,它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫色,使培養(yǎng)基呈淡粉紅色,大腸菌群發(fā)酵乳糖后產生的酸和乙醛即和復紅反應,形成深紅色復合物,使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色.亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長.伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅與美藍染料,在此亦作為指示劑,大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時,該兩種染料即結合成復合物,使大腸菌群產生與遠藤氏培養(yǎng)基上相似的,帶核心的,有金屬光澤的深紫色(龍膽紫的紫色)菌落.初發(fā)酵管24小時內產酸產氣和48小時產酸產氣的均需在以上平板上劃線分離菌落.
3.復發(fā)酵試驗
以上大腸菌群陽性菌落,經涂片染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌者,通過此試驗再進一步證實.原理與初發(fā)酵試驗相同,經24小時培養(yǎng)產酸又產氣的,最后確定為大腸菌群陽性結果.
三,器材
乳糖蛋白胨發(fā)酵管(內有倒置小套管),三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管(瓶)(內有倒置小套管),伊紅美藍瓊脂平板,滅菌水；
載玻片,滅菌帶玻璃塞空瓶,滅菌吸管,滅菌試管等.
四,操作步驟
1.水樣的采取
同實驗五十九.
2.自來水檢查
(1)初(步)發(fā)酵試驗在2個含有50毫升三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中,各加入100毫升水樣.在10支含有5毫升三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中,各加入10毫升水樣(如圖ⅩⅣ-1).混勻后,37攝氏度培養(yǎng)24小時,24小時未產氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48小時.
(2)平板分離經24小時培養(yǎng)后,將產酸產氣及48小時產酸產氣的發(fā)酵管(瓶),分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上,再于37攝氏度下培養(yǎng) 18—24小時,將符合下列特征的菌落的一小部分,進行涂片,革蘭氏染色,鏡檢.
(a)深紫黑色,有金屬光澤.
(b)紫黑色,不帶或略帶金屬光澤.
(c)淡紫紅色,中心顏色較深.
(3)復發(fā)酵試驗經涂片,染色,鏡檢,如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,則挑取該菌落的另一部分,重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中,每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1—3個, 37攝氏度培養(yǎng)24小時,結果若產酸又產氣,即證實有大腸菌群存在.
證實有大腸菌群存在后,再根據(jù)初發(fā)酵試驗的陽性管(瓶)數(shù)查表ⅩⅣ-2,即得大腸菌群數(shù).3.池水,河水或湖水等的檢查
(1)將水樣稀釋成10-1與10-2.
(2)分別吸取1毫升10-2,10-1的稀釋水樣和1毫升原水樣,各入裝有10毫升普通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中.另取10毫升和100毫升原水樣,分別注入裝有 5 毫升和50毫升三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液的試管(瓶)中.
(3)以下步驟同上述自來水的平板分離和復發(fā)酵試驗.
(4)將100,10,1,0.1(10-1)毫升水樣的發(fā)酵管結果查表ⅪⅤ-3,將10,1,0.1(10-1),0.01(10-2)毫升水樣的發(fā)酵管結果查表ⅪⅤ-4,即得每升水樣中的大腸菌群數(shù).