微生物實(shí)驗(yàn)：抗生素敏感試驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)常用培養(yǎng)基
抗生素敏感試驗(yàn)
瓊脂擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)(改良Kirby-Bauer法)
若只根據(jù)是否出現(xiàn)抑菌環(huán)而不考慮抑菌環(huán)的直徑大小,來(lái)判斷細(xì)菌是否對(duì)抗菌藥物敏感的實(shí)驗(yàn)方法,其結(jié)果是不正確的.而紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)原理,根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小與最低抑菌濃度的相關(guān)性,結(jié)合臨床上已知敏感或耐藥菌株的狀態(tài),其結(jié)果是可靠的.WHO推薦K-B法,其目的在于技術(shù)的簡(jiǎn)單和可重復(fù)性.本法特別適用于腸桿菌科細(xì)菌,也可用于快速生長(zhǎng)的致病菌,但不適用于其他細(xì)菌,如嗜血桿菌、奈瑟菌、專性厭氧菌及酵母樣菌等.無(wú)論用哪種方法接種,只要質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)在預(yù)期范圍內(nèi),均可按同一解釋標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告結(jié)果.但并非從感染患者分離到的微生物都必須做敏感試驗(yàn),對(duì)于污染、機(jī)體共生的正常細(xì)菌群和那些與感染無(wú)關(guān)的細(xì)菌,可不必做敏感試驗(yàn),只有那些被認(rèn)為引起感染的微生物,應(yīng)先分純、鑒定菌種后再做敏感試驗(yàn).
試驗(yàn)用材料
Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton瓊脂.多年大量的有關(guān)敏感試驗(yàn)的方法學(xué)研究,均采用該培養(yǎng)基,維持細(xì)菌正常發(fā)育,絕大多數(shù)細(xì)菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好.此培養(yǎng)基不拮抗抗菌藥物活性以及商品的批間差異等方面均優(yōu)于其他培養(yǎng)基.若檢測(cè)肺炎鏈球菌的敏感性時(shí),在培養(yǎng)基中加5％的脫纖維羊血,制成血平板.測(cè)嗜血桿菌及淋病奈瑟菌的敏感性時(shí),在培養(yǎng)基中須加入1％血紅素和2.5mg/毫升輔酶I后應(yīng)校正pH7.2至7.4.
制備MH瓊脂平板應(yīng)用直徑90cm平皿.在水平的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上傾制.瓊脂厚為4毫米,允許誤差為土l毫米.瓊脂凝固后,應(yīng)測(cè)一下pH是否正確.瓊脂于板應(yīng)放4攝氏度保存,在7日內(nèi)用完.
藥物紙片
抗菌藥物紙片直徑約為6.00至6.35毫米,每片的吸水量約20μl.采用K-B法,紙片的藥物含量必須與該法規(guī)定的一致,不得任意更改.藥物紙片可以購(gòu)買,也可自制,用前必須做質(zhì)量鑒定.用以下兩個(gè)指標(biāo)判定紙片的質(zhì)量:
片間差:是衡量不同紙片含藥是否均一的指標(biāo).測(cè)定方法:以質(zhì)控菌株接種M-H瓊脂平板,一塊平板上貼6張相同的紙片.35C過(guò)夜,培養(yǎng)后,記錄6個(gè)抑菌直徑,其最大和最小之差不應(yīng)大于1至2毫米.
準(zhǔn)確度:判定紙片的實(shí)際含藥量與標(biāo)量是否一致.
紙片的合理保存十分重要.藥物紙片必須在有干燥劑的容器內(nèi)低溫(-10攝氏度以下)保存.只拿出少量放4攝氏度備日常工作用.裝紙片的容器從冰箱取出后,必須在室內(nèi)溫暖l0分鐘以上才可打開.如立即打開,空氣中的水分會(huì)冷凝在紙片上,容易潮解.
細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按臨床的需要,決定敏感試驗(yàn)抗菌藥物的種類.同類抗菌藥物僅選用一個(gè)代表.應(yīng)根據(jù)測(cè)定細(xì)菌的屬種選藥.
質(zhì)控菌株
K—B法質(zhì)量控制用菌株常規(guī)用:金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853.測(cè)定MH瓊脂是否適合做磺胺類試驗(yàn),須用糞鏈球菌ATCC29212或33186.上述質(zhì)控菌株應(yīng)由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心供應(yīng).實(shí)驗(yàn)室保存菌株可用凍干法或保存在高層瓊脂中.常規(guī)質(zhì)量控制菌株應(yīng)每月更換1次.
質(zhì)控菌株簡(jiǎn)便保存方法:將新得到的凍干菌株接種含血的M-H平板復(fù)活.然后每株細(xì)菌接種10支高層瓊脂管,放置冰箱保存.每月取1支,傳種細(xì)菌供常規(guī)使用.待用剩至最后1支,再傳代在M-H平板上,接種一批高層瓊脂管備用.如此連續(xù)可避免原始菌種不接觸抗生素,以防變異.
菌液比濁管
為保證敏感試驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精密度,必須對(duì)接種菌液的濃度做相應(yīng)控制.采用比濁的辦法控制菌懸液濃度.接種菌液濃度為1.5×l08／m1,濁度相當(dāng)于麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管第1號(hào)管的1／2.
比濁管配法如下:
0.048mol／LBaCl20.5毫升
0.18mol／LH2SO499.5毫升
將二液置冰水浴中冷卻后混合,置螺口試管中,放室溫暗處保存.用前混勻.有效期為6個(gè)月.
操作方法
1,制備接種菌液:臨床標(biāo)本中分離的細(xì)菌做藥敏試驗(yàn),應(yīng)挑取已分純的菌落4至5個(gè)制備菌懸液.
制備菌液的方法是挑選瓊脂平板上、形態(tài)相同的菌落移種于M—H液體培養(yǎng)基中,置35攝氏度水箱中孵育4小時(shí),校正濁度,或用接種環(huán)挑取菌落,懸浮于生理鹽水中,振蕩混勻后與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁,以有黑字的白紙為背景,調(diào)整濁度與比濁管相同.此法制備接種菌液適用于任何細(xì)菌.
2,接種平板:制備好的接種菌液必須在15分鐘內(nèi)使用.用滅菌的棉拭子蘸取菌液:在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓幾次,去掉過(guò)多的菌液.用拭子涂布整個(gè)培養(yǎng)基表面,反復(fù)幾次,每次將乎板旋轉(zhuǎn)60°,最后沿平皿周邊繞兩圈,保證涂布均勻.
3,貼紙片:須待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片.用鑷子取紙片一張,貼在瓊脂平板表面,用鑷尖壓一下,使其貼平,紙片一貼就不可再拿起,因紙片中的藥物已擴(kuò)散到瓊脂中.每張紙片間距不少于24毫米,紙片中心距平皿邊緣不少于15毫米.直徑為90毫米的平板最好貼6張.貼上紙片后,須在15分鐘內(nèi)放35攝氏度孵箱培養(yǎng).不可放在CO2環(huán)境中.
4,孵育:必須用35攝氏度孵箱,平板在孵箱內(nèi)最好單獨(dú)擺放,不超過(guò)二個(gè)疊在一起,否則中間的平板,達(dá)不到孵箱溫度而產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)散的作用,平板孵育18至24h后,讀取結(jié)果.
5,判定結(jié)果:培養(yǎng)后取出平板,測(cè)量抑菌環(huán)的直徑.抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限.有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長(zhǎng),進(jìn)入抑菌環(huán),磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)輕微生長(zhǎng),這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣.
按抑菌環(huán)直徑判斷細(xì)菌的敏感性,應(yīng)依據(jù)所提供的解釋標(biāo)準(zhǔn),報(bào)告結(jié)果必須明確中介的含意,加以區(qū)別.
瓊脂稀釋法敏感試驗(yàn)
概述
瓊脂稀釋法敏感試驗(yàn)是將不同劑量的抗菌藥物,分別加于融化并冷至45攝氏度的定量瓊脂培養(yǎng)基中,混勻,傾注成無(wú)菌平板,即為含有藥物濃度遞減的培養(yǎng)基.接種幼齡菌于該培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)后觀察被檢菌的生長(zhǎng)情況,最低藥物濃度抑制細(xì)菌生長(zhǎng)者為該菌的最低抑菌濃度.其優(yōu)點(diǎn)是:
1．比液體稀釋法重復(fù)性好:
2．每個(gè)平板同時(shí)測(cè)定多株細(xì)菌:
3．可觀察被檢菌集落生長(zhǎng)良好與否:
4．發(fā)現(xiàn)被污染的菌落:
5．可引用機(jī)械化手段,提高效率.
材料和試驗(yàn)方法
1．抗菌藥物原液的配制:配制各種抗菌藥物原液的溶劑及稀釋劑.
2．抗生素稀釋.
3．培養(yǎng)基的制備及貯存:培養(yǎng)基為MH瓊脂,按廠家規(guī)定進(jìn)行配制時(shí)加水量要減少l／10,以備留給補(bǔ)充稀釋好的抗生素用,121攝氏度15分鐘滅菌,水浴中冷卻至48至50攝氏度:100毫米平皿加一個(gè)濃度的抗生素2.5毫升,再加入MH瓊脂25毫升(刻度燒杯量),充分混勻.已配制含有抗生素瓊脂平板,應(yīng)放在塑料袋內(nèi),4至8攝氏度中保存,用于質(zhì)控試驗(yàn)平板,只能保存5天,常規(guī)試驗(yàn)時(shí),略可延長(zhǎng)使用時(shí)間.
4．接種方法:為獲得準(zhǔn)確的MIC結(jié)果,接種被檢菌數(shù)量,必須控制在規(guī)定范圍內(nèi),即每個(gè)斑點(diǎn)中應(yīng)含104CFU.制備方法如下:挑選過(guò)夜瓊脂上培養(yǎng)物4至5個(gè)菌落接種于4至5mi肉湯中(如M—H肉湯、腦心浸液肉湯等).35攝氏度培養(yǎng)至微混濁,再調(diào)節(jié)至0.5號(hào)麥?zhǔn)瞎軡舛?108CFU／m1).也可挑選過(guò)夜生長(zhǎng)的瓊脂上純菌落,直接用鹽水稀釋比濁到0.5號(hào)麥?zhǔn)瞎軡舛?再1:10稀釋成為107CFU／毫升,30分鐘內(nèi),將上述被檢菌株懸液接種至含抗生素的一系列平板上.接種方法有多種,最好是用接種器,一次可接種大約36個(gè)菌株,每根針約可傳種2μl菌液.接種前平板必須相當(dāng)干燥,操作時(shí)從最低濃度的瓊脂平板種起.為了核對(duì)每個(gè)被驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)或污染狀況,最后還需點(diǎn)種一個(gè)不含抗生素的對(duì)照平板:即將每株被檢菌懸液,用定量加液器吸取1μl菌液,接種在1／2無(wú)抗生素的M-H瓊脂平皿上,充分劃線,第二日觀察有否污染,菌落計(jì)數(shù),菌數(shù)大約為104CFU／毫升.
每次檢測(cè)要用質(zhì)控菌種跟隨操作.
5．孵育:接種好的平板,放置室溫讓接種液被充分吸干后,置35,C溫箱內(nèi)16至20h讀取結(jié)果.特殊菌種的抗生素敏感試驗(yàn)所需要的條件見另節(jié).
讀取結(jié)果及報(bào)告
首先讀質(zhì)控平板的MIC,然后讀取被檢菌株測(cè)定的MIC值:在前后二個(gè)不同梯度濃度的抗生素M-H瓊脂平板上,細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)量有80至90％的突然減少為結(jié)果終點(diǎn),即MIC值.
有幾點(diǎn)要注意的:薄霧狀生長(zhǎng)不算:<5個(gè)菌落不算:若在數(shù)個(gè)平板上呈拖尾或跳管生長(zhǎng)等現(xiàn)象,應(yīng)該重做.
MIC單位為μg/毫升,根據(jù)MIC值參照表,報(bào)告相應(yīng)的敏感或耐藥結(jié)果,或同時(shí)將MIC值附在敏感或耐藥后面.
在測(cè)定同時(shí),可用質(zhì)控菌株檢測(cè)MIC,以控制本次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性.