抗生素產(chǎn)生菌的體外鑒別
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
大豆預(yù)灌裝無菌培養(yǎng)平皿
抗生素產(chǎn)生菌的體外鑒別
了解抗生素產(chǎn)生菌體外篩選法的原理.
學(xué)習(xí)并掌握抗生菌的鑒別方法.
原理
由土壤中分出的放線菌需進(jìn)一步鑒別是否為需要的抗生菌.首先應(yīng)根據(jù)篩選目的確定試驗(yàn)?zāi)Ｐ?然后利用培養(yǎng)基平板進(jìn)行拮抗性測定.常用的方法有瓊脂塊法和濾紙片法.其主要依據(jù)是擴(kuò)散原理,即觀察在抗生菌周圍是否會出現(xiàn)明顯的抑菌圈.抑菌圈的大小和透明度則表明了該菌株抗菌活性的強(qiáng)弱.本實(shí)驗(yàn)選用了這兩種方法.
儀器與材料
培養(yǎng)基:500毫升三角瓶中分裝300毫升黃豆餅粉瓊脂,18×180毫米試管分裝4毫升黃豆餅粉浸汁,300毫升三角瓶分裝150毫升細(xì)菌培養(yǎng)基,150毫升三角瓶分裝50毫升馬鈴薯培養(yǎng)基.
試驗(yàn)菌:
枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),大腸桿菌(Escherichiacoli),金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus),深紅酵母(Ruodotorularubra)
待測菌株:
瓊脂培養(yǎng)物:將融化的黃豆餅粉瓊脂倒入無菌培養(yǎng)皿,制成平板.用記號筆在平皿背面畫一直線,將平皿一分為二,分別注明待測菌株的編號.并按照編號將待測菌株密集劃線接入平板.同法接入華美鏈霉菌(Streptomycessplendens)和金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)作為對照菌,28攝氏度下培養(yǎng)7天.
發(fā)酵液:將待測菌株和對照菌分別接入黃豆餅粉培養(yǎng)液,作好標(biāo)記,28攝氏度下振蕩培養(yǎng)7天.
滅菌物品:培養(yǎng)皿,打孔器,鑷子,圓濾紙片,15×150毫米試管分裝5毫升無菌水,1毫升吸管,無菌漏斗.
其它:接種用具,游標(biāo)卡尺,記號筆,搖床.
方法
瓊脂塊法
1、分別取枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各1支,加入5毫升無菌水制成菌懸液,備用.
2、取9套無菌培養(yǎng)皿,向每套培養(yǎng)皿中分別加入1毫升試驗(yàn)菌懸液,然后加入約12毫升冷卻至45攝氏度左右的細(xì)菌培養(yǎng)基,迅速在實(shí)驗(yàn)臺上搖勻,制成指示菌平板.每1種指示菌3個(gè)重復(fù),并注明指示菌及測定菌株的位置.
3、用無菌打孔器將待測菌株和對照菌的黃豆餅粉瓊脂培養(yǎng)物切塊,每種培養(yǎng)物9塊.
4、用無菌接種針,將待測菌株和對照菌瓊脂塊分別移入各指示菌平板的相應(yīng)位置上,菌面朝上,間隔均勻擺放.
5、靜置20分鐘后,放入恒溫箱,37攝氏度下培養(yǎng)18～24h.
6、用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑,并觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度.
濾紙片法
1、向深紅酵母菌斜面中加入5毫升無菌水,制成菌懸液.
2、向已冷卻至45攝氏度左右的馬鈴薯培養(yǎng)基中加入0.5毫升深紅酵母菌懸液,搖勻后,倒3個(gè)指示菌平板,并在平皿背面標(biāo)明測定菌株的位置,備用.
3、過濾各測定菌株的發(fā)酵液.
4、用無菌鑷子取無菌的圓濾紙片,蘸取各測定菌株的發(fā)酵濾液,放入指示菌平板的相應(yīng)位置上,每1測定菌株3個(gè)重復(fù).
5、靜置20分鐘后,28攝氏度下培養(yǎng)2天.
6、用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑,并觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度.
管碟法
雙層平板法底層培養(yǎng)基采用2%瓊脂培養(yǎng)基,上層培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基.在每個(gè)培養(yǎng)皿中用無菌吸管加人10毫升底層培養(yǎng)基,待冷凝后,再將7毫升已融化冷卻至45攝氏度的上層培養(yǎng)基(已接種供試病原細(xì)菌)倒人已凝固的底層培養(yǎng)基表面,待凝固后即可在每個(gè)培養(yǎng)皿上輕輕放置無菌牛津杯,每皿放置4個(gè),牛津杯之間的距離相等.然后在每個(gè)牛津杯中接人菌株發(fā)酵液0.2mI,置于25攝氏度恒溫箱中培養(yǎng),24h后測量抑菌圈大小.
抑制菌絲生長速率法
將菌株發(fā)酵液l毫升與9毫升融化的PDA培養(yǎng)基混勻,倒入無菌培養(yǎng)皿中制成帶藥培養(yǎng)基平板.培養(yǎng)基凝固后,在每個(gè)培養(yǎng)基平板上放人1個(gè)供試病原真菌菌餅工直徑為4毫米),使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面,每處理重復(fù)3次.置于25攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)72~96h后,用十字交叉法測量供試病原真菌菌落生長直徑,用下式計(jì)算抑制率
計(jì)數(shù)法
將2種病原弧菌各自與4株拮抗放線菌分別制成菌懸液,取每種菌懸液0.5毫升分別接入裝有肉湯的三角瓶中,28攝氏度水浴振蕩培養(yǎng),并從培養(yǎng)0,12,24和48h等4個(gè)不同時(shí)間的三角瓶中各取出少量菌液分別涂布于TCBS和高氏一號培養(yǎng)基上,在28攝氏度下培養(yǎng)24h后,用平板菌落計(jì)數(shù)法測定病原弧菌和放線菌的濃度,以不加拮抗放線菌的病原弧菌培養(yǎng)液為對照.
覆蓋技術(shù)
將試驗(yàn)菌點(diǎn)種VNSS平板生長7d,然后覆蓋含有指示菌菌懸液(培養(yǎng)過夜)的6g/LVNSS瓊脂,室溫培養(yǎng)48h后測定菌落直徑(Dc)和抑菌圈直徑(Di),以兩者比值(Di/Dc)表示抑菌活性.