微生物培養(yǎng)基技術(shù)：抗生素檢定實(shí)驗(yàn)（第2部分）
發(fā)布時(shí)間：
2024-09-11
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微生物培養(yǎng)基技術(shù)：抗生素檢定實(shí)驗(yàn)（第2部分）
管碟法基本原理
抗生素微生物檢定管碟測(cè)定法系瓊脂擴(kuò)散法，是利用抗生素在攤布特定試驗(yàn)菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)成球面形擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈。此法是根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)，通過檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。
劑量法：
二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18?22mm
雙碟不得少于4個(gè)，高、低濃度的劑距為2：1或4：1。在雙碟的 4 個(gè)鋼管中分別成“Z”字形滴加標(biāo)準(zhǔn)品（S）及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液，即滴加溶液的順序?yàn)?SH －TH－TL－SL。三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15?18mm。
三劑量法：雙碟不得少于6個(gè)，高、低濃度的劑距為1：0.8。 6個(gè)鋼管中間隔 3 個(gè)鋼管中分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品及供試品高（H）、中（M）、低（L）3 種濃度溶液，并使相同濃度成對(duì)角按SH→TH→SM→TM→SL→TL 或TH→SH→TM→SM→TL→SL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、中、低劑量溶液。
抑菌圈測(cè)量
測(cè)量抑菌圈可以使用抑菌圈測(cè)量?jī)x，也可用游標(biāo)卡尺；使用的抑菌圈測(cè)量?jī)x應(yīng)經(jīng)過檢定，并符合檢定規(guī)程的要求，操作時(shí)應(yīng)按儀器的操作規(guī)程進(jìn)行：使用游標(biāo)卡尺測(cè)量時(shí)，眼睛視線應(yīng)與讀數(shù)刻度垂直，用卡尺的尖端與抑菌圈直徑的切點(diǎn)成垂直方向測(cè)量。
抑菌圈形狀的控制
操作中也應(yīng)當(dāng)保證藥液持續(xù)滴入，并且和鋼管的距離保持在適中的范圍，避免液滴下滴時(shí)藥液濺出，滴落在培養(yǎng)基面上，形成破圈。
放置牛津杯要從同一高度平穩(wěn)、垂直放置，相應(yīng)劑量的鋼管對(duì)角均勻放置，且注意鋼管與鋼管，鋼管與雙碟邊緣的距離。牛津杯在瓊脂培養(yǎng)基上靜置5-10min沉降穩(wěn)定后，再滴加抗生素溶液。
操作時(shí)一定要防止材料、器具、環(huán)境被抗生素污染,避免破圈。滴加抗生素時(shí)間不宜過長(zhǎng)，因?yàn)殇摴軆?nèi)溶液擴(kuò)散時(shí)間不同，會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議點(diǎn)樣時(shí)間最多不超10min。加樣量一定要適量，滴加量過多溢出導(dǎo)致抑菌圈不圓，量太少則抑菌圈直徑達(dá)不到18-22mm。
培養(yǎng)基溫度控制：底層培養(yǎng)基傾倒注意培養(yǎng)基溫度不可太低，應(yīng)控制在 60～80℃。如果溫度太低，則容易在內(nèi)部結(jié)塊，加注到雙碟之后不能均勻鋪開，會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來誤差；制備瓊脂培養(yǎng)基菌層時(shí)，培養(yǎng)基溫度的掌握至關(guān)重要，一般情況下霉菌、球菌不耐熱，操作時(shí)應(yīng)控制溫度在48～50℃，芽孢類： 60～65℃， 溫度過高或受熱時(shí)間太長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)菌死亡，出現(xiàn)無(wú)抑菌圈現(xiàn)象；溫度過低則培養(yǎng)基凝固，導(dǎo)致菌層厚度不均，影響抑菌圈直徑。
同批雙碟放在同一層盤。雙碟疊放不可超過 3 層，以免受熱不均，影響抑菌圈大小
工作臺(tái)用水平儀校正墊平。
防止培養(yǎng)基驟冷驟熱，避免培養(yǎng)基中形成小凝塊。
所用的緩沖液pH 值和鹽濃度的影響。
四環(huán)素類抗生素 ，當(dāng)抗生素溶液的pH 過低時(shí)形成的抑菌圈可呈卵圓形。
硫酸鏈霉素， 如鹽濃度太高或pH 值過低，就會(huì)不顯抑菌圈或呈向心型的卵圓形抑菌圈，如稀釋用緩沖液濃度如較藥典規(guī)定濃度增大10 倍或緩沖液pH 為6.0，則完全無(wú)抑菌圈產(chǎn)生。
抑菌圈直徑的控制
抑菌圈大圈直徑應(yīng)控制在18～22mm 之間
抑菌圈大小受T 值增減影響，若要使抑菌圈直徑變小可預(yù)先培養(yǎng)一段時(shí)間再滴碟；若要使抑菌圈直徑變大可滴碟后預(yù)先擴(kuò)散一定時(shí)間再進(jìn)行培養(yǎng)。
改變培養(yǎng)基和緩沖液中的鹽濃度來控制抑菌圈直徑。例如，新霉素和多粘菌素緩沖液中加入3％NaCl 或培養(yǎng)基中加一定鹽和吐溫可改變擴(kuò)散系數(shù)D 使抑菌圈增大。
改變培養(yǎng)基的pH 值來控制抑菌圈直徑，堿性抗生素在偏堿性培養(yǎng)基中抗菌效力強(qiáng)抑菌圈增大，酸性抗生素在偏酸性培養(yǎng)基中抗菌效力強(qiáng)抑菌圈增大。 例如， 硫酸鏈霉素、乙酰螺旋霉素為堿性抗生素， 通過提高培養(yǎng)基pH 值至8.0～8.2 可增大抑菌圈直徑。
試驗(yàn)菌是影響抑菌圈直徑的一重要因素。應(yīng)及時(shí)更換試驗(yàn)菌，使用新鮮菌液，可提高試驗(yàn)的靈敏度，增大抑菌圈直徑。
抑菌圈清晰度的控制
抑制圈的邊緣清晰度是影響監(jiān)測(cè)結(jié)果重要的指標(biāo)因素之一，而一般來說因?yàn)樾纬梢志Φ臅r(shí)候擴(kuò)散系數(shù)不均勻，導(dǎo)致這種情況發(fā)生的原因在于檢測(cè)菌液中菌齡不等，因此需要做好檢測(cè)菌株的純化工作，從而提升抗生素整體活性。
做好檢定菌種純化工作，定期傳代培養(yǎng)保持新鮮度。
培養(yǎng)基雜質(zhì)影響擴(kuò)散系統(tǒng)。
選用進(jìn)口蛋白胨、酵母粉、牛肉粉配制的Ⅱ ，測(cè)定大觀霉素效價(jià)時(shí)形成的抑菌圈比較清晰，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，可信限率和復(fù)試率低。
抗生素中有雜質(zhì)和其它組份的影響
麥白霉素形成的抑菌圈清晰度較差而且有雙圈。
殺菌型抗生素如鏈霉素、硫酸慶大霉素 形成的抑菌圈邊緣光滑清晰。 抑菌型抗生素如氯霉素、土霉素抑菌圈邊緣模糊或出現(xiàn)雙圈。泰利菌素對(duì)藤黃微球菌殺滅作用較弱，抑菌圈邊緣清晰度較差，對(duì)枯草芽孢桿菌殺滅作用較強(qiáng)，抑菌圈邊緣清晰
數(shù)據(jù)處理
每批至少有4個(gè)雙碟的結(jié)果，方可出報(bào)告，而且抑菌圈不得有一個(gè)破裂或不圓的情況
測(cè)得的效價(jià)如低于估計(jì)效價(jià)90%或高于110%時(shí)，應(yīng)調(diào)整估計(jì)效價(jià)，予以重試
可靠性測(cè)驗(yàn)應(yīng)符合規(guī)定，否則不能計(jì)算效價(jià)和可信限率。
二劑量法回歸項(xiàng)應(yīng)非常顯著(p<0.01)，偏離平行應(yīng)不顯著(p>0.05)；三劑量法，除二劑量法的規(guī)定外，尚需考察二次曲線和反向二次曲線，且二者均應(yīng)不顯著（P>0.05），符合以上各項(xiàng)規(guī)定后，才能認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果可靠，方可進(jìn)行效價(jià)和可信限率計(jì)算。
除另有規(guī)定外,可信限率不得超過5.0%
依法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行特異反應(yīng)剔除， 剔除特異反應(yīng)時(shí)應(yīng)將特異雙碟整個(gè)除去
有明顯特大、特小圈均應(yīng)去除。
比平均值高或低0.5mm，而本批碟子中又無(wú)低或高相同數(shù)目的雙碟可去除。
去除某雙碟后結(jié)果增加或降低1.2%以上，而本批碟子中又無(wú)使結(jié)果降低或增加相同數(shù)目的雙碟可去除。
其他
稱量
20mg ，50mg
稀釋
“稀溶液大體積”的原則， 不少于2.00ml。
稀釋步驟一般不超過 3 步。
