微生物培養(yǎng)基技術(shù)：抗生素檢定實(shí)驗(yàn)（第3部分）
發(fā)布時(shí)間：
2024-09-11
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微生物培養(yǎng)基技術(shù)：抗生素檢定實(shí)驗(yàn)（第3部分）
比濁法
基本原理
抗生素微生物比濁法是將一定量的抗生素加至接種有試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混均后，經(jīng)培養(yǎng)，測量培養(yǎng)基濁度。
操作要點(diǎn)
預(yù)實(shí)驗(yàn)
確定最佳的試驗(yàn)條件：高、低劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的菌液濃度的吸收值在0.3-0.7范圍；高、低劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的菌液濃度的吸收值的差值大于0.1為佳。
操作要點(diǎn)
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
比色管、攪拌轉(zhuǎn)子、塞子的清洗及滅菌
容量瓶、定量吸管的清洗
培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無菌間的紫外消毒等應(yīng)符合抗生素微生物檢定法要求
供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
估計(jì)供試品的效價(jià)，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液
標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的稀釋應(yīng)使用經(jīng)標(biāo)定的量瓶，每步稀釋的量取量以不少于 2ml 為宜，稀釋步驟一般不超過 3步。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液選擇 5 個(gè)劑量，劑量間的比例應(yīng)適宜（通常為1:1.25 或更小）；供試品溶液根據(jù)估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量，取供試品按標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法，選擇中間濃度，不少于3 個(gè)試管
菌液培養(yǎng)基的制備
臨用前，取規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（35～37℃培養(yǎng) 3～4小時(shí)后測定的吸光度在 0.3～0.7 之間），加入到各液體培養(yǎng)基管中，混合均勻，使在試驗(yàn)條件下能得到滿意的劑量－反應(yīng)關(guān)系和適宜的測定濁度（吸光度）。含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基在配制后應(yīng)立即使用，必要時(shí)可適當(dāng)冷卻，以防止試驗(yàn)菌在培養(yǎng)前生長。
加抗生素溶液
在比色管中定量加入抗生素溶液后，再定量加入菌液培養(yǎng)基，混勻后，在規(guī)定溫度培養(yǎng)
注意事項(xiàng)
培養(yǎng)溫度的控制：管碟法(37±0.5)℃ ，比濁法(37±0.1)℃，保證各點(diǎn)溫度的均勻是保證細(xì)菌正常生長的關(guān)鍵因素
儀器中的感溫器必須正確放置。試驗(yàn)中采用振搖培養(yǎng)，避免細(xì)菌沉降于比色池底部，增加氧氣循環(huán)，有利于細(xì)菌生長
菌液的影響因素控制
新鮮配制
培養(yǎng)基成分及pH影響細(xì)菌的生長速度，其與培養(yǎng)溫度、通氣條件及細(xì)菌內(nèi)在的繁殖能力有關(guān)pH偏低 金黃色葡萄球菌生長緩慢，pH過高會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏離，通常適宜培養(yǎng)基的pH滅菌后應(yīng)在7.0～7.2
吸收度處于測量范圍在0.3～0.7內(nèi)
加菌量的多少（0.25%、0.5%、1.0%）影響培養(yǎng)至適
宜的菌液測定濃度所用的時(shí)間，若加菌量過少，則測定時(shí)可利用的濃度范圍窄
抗生素各濃度之間的吸收度的梯度達(dá)0.1以上為佳
測定后的比色管可用硝酸－硫酸（5：95）浸泡并用蒸餾水沖洗干凈，注意避免污漬和劃痕，除去纖維、顆粒等雜質(zhì)
測定比濁法讀數(shù)前應(yīng)搖勻培養(yǎng)基并經(jīng)靜置待氣泡消失后再進(jìn)行測定
