微生物源酶制劑抗菌活性的測定
發(fā)布時間：
2022-12-24
作者：
食品微生物學檢驗
微生物源酶制劑抗菌活性的測定GB4789.43-2016
1.1 胰蛋白胨大豆瓊脂(TryptoneSoyAgar,TSA), 胰蛋白胨大豆肉湯(TryptoneSoyBroth,TSB),平板計數(shù)瓊脂(PlateCountAgar),0.1mol/LHCl,無菌生理鹽水,50.0μg/毫升環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)溶液,5.0μg/片環(huán)丙沙星紙片
2.試驗菌株
金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538,大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229,蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)ATCC2,環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)ATCC4516,化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC12344,粘質沙雷菌(Serratiamarcescens)ATCC14041。
3.檢驗程序步驟圖
4 操作步驟
4.1 試驗菌懸液原液制備
將金黃色葡萄球菌(ATCC6538),大腸埃希氏菌(ATCC11229),蠟樣芽孢桿菌(ATCC2),環(huán)狀芽孢桿菌(ATCC4516),化膿性鏈球菌(ATCC12344),粘質沙雷菌(ATCC14041)凍存菌株分別接種于盛有5毫升TSB的試管,置36攝氏度±1攝氏度培養(yǎng)18h~24h進行第一次傳代培養(yǎng),分別挑取第一次傳代培養(yǎng)液1~2環(huán)轉種于5毫升TSB肉湯,置36攝氏度±1攝氏度培養(yǎng)18h~24h進行二次傳代培養(yǎng),作為試驗菌懸液原液備用。
試驗菌懸液原液純度檢測:分別挑取試驗菌懸液原液各一環(huán),劃線接種于TSA 平板,36 攝氏度±1 攝氏度培養(yǎng)20h~24h,觀察純度。
4.2 菌懸液原液濃度測定
4.2.1 菌懸液原液稀釋
分別取4.1中制備的菌懸液原液依次進行十倍梯度稀釋,蠟樣芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌分別制成10-4稀釋液,金黃色葡萄球菌,大腸埃希氏菌,化膿性鏈球菌,粘質沙雷菌分別制成10-5稀釋液。
4.2.2 培養(yǎng)計數(shù)
分別吸取4.2.1中制備好的各菌稀釋液1毫升于無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平行,并用無菌生理鹽水作空白對照。向平皿中傾注冷卻至46攝氏度左右(可放置于46攝氏度±1攝氏度的恒溫水浴箱中保溫)的平板計數(shù)瓊脂15毫升~20毫升,并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板翻轉,于36攝氏度±1攝氏度培養(yǎng)24h后計數(shù),各菌懸液原液中菌濃度均大于106 CFU/毫升時方可使用。
4.3 檢測平板制備
傾注融化并冷卻至46攝氏度±1攝氏度的TSA 培養(yǎng)基15毫升于無菌培養(yǎng)皿內,待其凝固后制成TSA 平板,備用。
將4.1中二次傳代后的各菌培養(yǎng)物分別用冷卻至46攝氏度±1攝氏度的TSA 培養(yǎng)基按1∶10的比例稀釋(其中化膿性鏈球菌ATCC12344按1∶20的比例稀釋),充分混勻后各取10毫升至上述已制備好,于46攝氏度±1攝氏度中保溫的TSA 平板內,輕輕搖動平板使菌液均勻鋪平,待其凝固后制成檢測平板,備用。
注:為防止含菌培養(yǎng)基遇到TSA后馬上凝固,引起菌懸液鋪板不均勻,菌懸液鋪板前應事先將TSA平板置于46攝氏度±1攝氏度條件下保溫平衡10min。
4.4 酶制劑紙片的制備
準確稱(移)取1.0g(毫升)酶制劑于9毫升無菌生理鹽水中,充分混勻后制成10%的酶制劑溶液。
將無菌紙片放入無菌平皿內,在每張紙片上緩緩滴加100μL10%的酶制劑溶液,使其全部吸收,每種酶制劑樣品制備12張紙片。
4.5 貼紙片及培養(yǎng)
將4.4中制備的含待測酶制劑的紙片,含環(huán)丙沙星的陽性對照紙片(見A.7)和含100μL無菌生理鹽水的空白陰性對照紙片用無菌鑷子分別置4.3中制備的檢測平板上,每個平板貼2張紙片(2張含待測酶制劑的紙片或2張含環(huán)丙沙星的紙片或2張空白紙片),兩紙片圓點的間距大于32毫米,每個標準菌株分別設一陽性對照和一陰性對照平板。將平板正置于4攝氏度±0.5 攝氏度冰箱內過夜(12h~16h)。第二天轉入36攝氏度±1攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,測定酶制劑樣品,環(huán)丙沙星和陰性對照紙片形成的抑菌圈。
5 抗菌活性結果報告
5.1 結果判定
若待測酶制劑對3種或3種以上受試微生物呈現(xiàn)出抗菌活性,即紙片周圍出現(xiàn)清晰可見的抑菌圈(每個抑菌圈直徑≥16毫米),且陽性對照環(huán)丙沙星紙片對金黃色葡萄球菌,蠟樣芽孢桿菌,粘質沙雷菌,環(huán)狀芽孢桿菌,化膿性鏈球菌5種細菌形成的抑菌圈均>16毫米,則判定該酶制劑樣品中存在抗菌活性物質。
5.2 結果報告
報告樣品中檢出抗菌活性或未檢出抗菌活性。