微生物培養(yǎng)基配制和菌步驟
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
微生物培養(yǎng)基配制和菌步驟
微生物培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料,由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類型,對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同,加之研究的目的不同,所以培養(yǎng)基的種類很多,使用的原料也各有差異,但從營(yíng)養(yǎng)角度分析,微生物培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)素以及水分等.另外,培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓.
培養(yǎng)基是微生物實(shí)驗(yàn)必不可少的,需要進(jìn)行培養(yǎng)基配制和滅菌,那么微生物培養(yǎng)基該如何配制、培養(yǎng)基滅菌是否徹底,滅菌后如何儲(chǔ)存?
培養(yǎng)基的制備
1、配制溶液
向容器內(nèi)加入所需水量的一部分,按照培養(yǎng)基的配方,稱取各種原料,依次加入使其溶解,最后補(bǔ)足所需水分,對(duì)蛋白胨、肉膏等物質(zhì),需加熱溶解,加熱過程所蒸發(fā)的水分,應(yīng)在全部原料溶解后加水補(bǔ)足.
配制固體培養(yǎng)基時(shí),先將上述已配好的液體培養(yǎng)基煮沸,再將稱好的瓊脂加入,繼續(xù)加熱至完全融化,并不斷攪拌,以免瓊脂糊底燒焦.
2、調(diào)節(jié)pH值
用pH試紙(或pH計(jì)、氫離子濃度比色計(jì))測(cè)試培養(yǎng)基的pH值,如不符合需要,可用10%HCl或10%NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié),直到調(diào)節(jié)到配方要求的pH值為止.
3、過濾
用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養(yǎng)基過濾.用紗布過濾時(shí),最好折疊成六層,用濾紙過濾時(shí),可將濾紙折疊成瓦棱形,鋪在漏斗上過濾.
4、分裝
已過濾的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行分裝.如果要制作斜面培養(yǎng)基,須將培養(yǎng)基分裝于試管中.如果要制作平板培養(yǎng)基或液體、半固體培養(yǎng)基,則須將培養(yǎng)基分裝于錐形瓶?jī)?nèi).分裝時(shí),一手捏松彈簧夾,使培養(yǎng)基流出,另一只手握住幾支試管或錐形瓶,依次接取培養(yǎng)基.分裝時(shí),注意不要使培養(yǎng)基粘附管口或瓶口,以免浸濕棉塞引起雜菌污染.裝入試管的培養(yǎng)基量,視試管和錐形瓶的大小及需要而定.一般制作斜面培養(yǎng)基時(shí),每只15×150毫米的試管,約裝3至4毫升(1/4至1/3試管高度),如制作深層培養(yǎng)基,每只20×220毫米的試管約裝12至15毫升.每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基,一般以其容積的一半為宜.
5、加棉塞
分裝完畢后,需要用棉塞堵住管口或瓶口.堵棉塞的主要目的是過濾空氣,避免污染.棉塞應(yīng)采用普通新鮮、干燥的棉花制作,不要用脫脂棉,以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用.制作棉塞時(shí),要根據(jù)棉塞大小將棉花鋪展成適當(dāng)厚度,揪取手掌心大小一塊,鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中,用右手食指插入棉花中部,同時(shí)左手食指與姆指稍稍緊握,就會(huì)形成1個(gè)長(zhǎng)棒形的棉塞.棉塞作成后,應(yīng)迅速塞入管口或瓶口中,棉塞應(yīng)緊貼內(nèi)壁不留縫隙,以防空氣中微生物沿皺折侵入.棉塞不要過緊過松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落為合適.棉塞的2/3應(yīng)在管內(nèi)或瓶?jī)?nèi),上端露出少許棉花便于拔取.塞好棉塞的試管和錐形瓶應(yīng)蓋上厚紙用繩捆札,準(zhǔn)備滅菌.
6、制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基
培養(yǎng)基滅菌后,如制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基,須趁培養(yǎng)基未凝固時(shí)進(jìn)行.
(1)制作斜面培養(yǎng)基.在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放1支長(zhǎng)0.5至1米左右的木條,厚度為1厘米左右,將試管頭部枕在木條上,使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜,凝固后即成斜面培養(yǎng)基.
(2)制作平板培養(yǎng)基.將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,點(diǎn)燃酒精燈,右手托起錐形瓶瓶底,左手拔下棉塞,將瓶口在酒精燈上稍加灼燒,左手打開培養(yǎng)皿蓋,右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,每皿約倒入10毫升,以鋪滿皿底為度.鋪放培養(yǎng)基后放置15分鐘左右,待培養(yǎng)基凝固后,再5個(gè)培養(yǎng)皿一疊,倒置過來,平放在恒溫箱里,24小時(shí)后檢查,如培養(yǎng)基末長(zhǎng)雜菌,即可用來培養(yǎng)微生物.
培養(yǎng)基滅菌效果的影響因素有哪些
1、營(yíng)養(yǎng)成分的保持
濕熱滅菌時(shí),微生物被殺死的同時(shí),培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分也遭到了一定的破壞,特別是氨基酸和維生素.如在121攝氏度,僅20分鐘,就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞,蛋氨酸和色氨酸也有相當(dāng)數(shù)量被破壞.在熱的作用下某些營(yíng)養(yǎng)成分還可能因受熱而相互之間發(fā)生反應(yīng),造成培養(yǎng)基中原有營(yíng)養(yǎng)成分的數(shù)量變化,因而影響培養(yǎng)基質(zhì)量.
2、微生物的耐熱性
細(xì)菌芽孢的熱阻較大,滅菌所需要的時(shí)間取決于把細(xì)菌芽孢減少到所規(guī)定數(shù)目的時(shí)間.
3、pH值
pH值對(duì)微生物的耐熱性影響很大.pH值介于6.0~8.0時(shí),微生物最不易死亡.pH<6.0時(shí),微生物比較容易死亡,此時(shí)H+很容易滲入微生物的細(xì)胞,從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng),促使其死亡.所以培養(yǎng)基的pH越低,所需的時(shí)間也越短.
4、培養(yǎng)基成分
油脂、糖類及蛋白質(zhì)等組成的高濃度有機(jī)物會(huì)包于細(xì)胞的周圍形式一層薄膜、影響熱的傳導(dǎo).而高濃度的鹽類、色素則削弱其耐熱性,滅菌較易.例如:大腸桿菌在水中加熱至60-65攝氏度便死亡,在10%糖液中需70攝氏度加熱4-6分鐘才死亡,在30%糖液中需30分鐘才死亡.一般糖類含量較多的時(shí)候最好選用115攝氏度,30分鐘;一般的培養(yǎng)基可選擇121攝氏度20分鐘.
5、泡沫
泡沫中的空氣形成隔熱層,使熱量難以滲透進(jìn)去,殺死其中的雜菌.
6、顆粒
顆粒小,容易滅菌,顆粒大,則難滅菌.對(duì)于含有少量較大顆粒及粗纖維的培養(yǎng)基,可用粗濾的方法(不應(yīng)影響培養(yǎng)基質(zhì)量)予以除去,培養(yǎng)基結(jié)塊會(huì)造成培養(yǎng)基滅菌的不徹底.
7、滅菌鍋內(nèi)空氣是否排凈
這個(gè)是影響滅菌是溫度和壓力比例關(guān)系的要點(diǎn),同樣達(dá)到了相同的壓力的情況下,如果空氣未能排凈,也就是說不是純蒸汽滅菌,此時(shí)的溫度不一定能達(dá)到目的要求,會(huì)嚴(yán)重影響滅菌效果.
滅菌后的培養(yǎng)基存放時(shí)間和保存方式
1、瓊脂培養(yǎng)基的融化
將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法(如高壓鍋中的層流蒸汽)使之融化.經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重新加熱時(shí)間,融化后避免過度加熱.融化后應(yīng)短暫置于室溫中(如2分鐘)以避免玻璃瓶破碎.
融化后的培養(yǎng)基放入47攝氏度至50攝氏度的恒溫水浴鍋中冷卻保溫(可根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)基凝固溫度適當(dāng)提高水浴鍋溫度),直至使用,培養(yǎng)基達(dá)到47攝氏度至50攝氏度的時(shí)間與培養(yǎng)基的品種、體積、數(shù)量有關(guān).融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用,放置時(shí)間一般不應(yīng)超過4h.未用完的培養(yǎng)基不能重新凝固留待下次使用.敏感的培養(yǎng)基尤應(yīng)注意,融化后保溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短,如有特定要求可參考指定的標(biāo)準(zhǔn).
傾注到樣品中的培養(yǎng)基溫度應(yīng)控制在約45攝氏度左右.
2、平板的制備和儲(chǔ)存
傾注融化的培養(yǎng)基到平皿中,使之在平皿中形成厚度至少為3毫米(直徑90毫米的平皿,通常要加入18毫升至20毫升瓊脂培養(yǎng)基).將平皿蓋好皿蓋后放到水平平面使瓊脂冷卻凝固.如果平板需儲(chǔ)存,或者培養(yǎng)時(shí)間超過48h或培養(yǎng)溫度高于40攝氏度,則需要傾注更多的培養(yǎng)基.凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和(或)5攝氏度±3攝氏度冰箱的密封袋中,以防止培養(yǎng)基成分的改變.在平板底部或側(cè)邊做好標(biāo)記,標(biāo)記的內(nèi)容包括名稱、制備日期和(或)有效期.也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記.
將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長(zhǎng)儲(chǔ)存期限.為了避免冷凝水的產(chǎn)生,平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中.儲(chǔ)存前不要對(duì)培養(yǎng)基表面進(jìn)行干燥處理.對(duì)于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基,應(yīng)先對(duì)瓊脂表面進(jìn)行干燥:揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱或培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)為25攝氏度至50攝氏度);或放在有對(duì)流的無菌凈化臺(tái)中,直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止.注意不要過度干燥.