菌種的保存方法匯總及操作步驟有哪些
發(fā)布時間：
2022-12-27
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菌種的保存方法匯總及操作步驟有哪些
需氧菌保存
冷凍干燥法
將待保存菌培養(yǎng)18至24小時后,挑取菌落或者菌苔,加入一定量的肉湯培養(yǎng)基(牛肉湯或者心腦浸出液加入20%蔗糖)混勻,分裝于安瓿瓶中,放置于至70攝氏度低溫冰箱中迅速凍結,再放入冷凍干燥機內,抽真空16至24小時,然后將安瓿瓶封口,置低溫冰箱保存.大多數(shù)菌株可保存10年以上.
超冰凍法
保存菌株初代培養(yǎng)18至24小時的菌落、菌苔加入0.5至1.0毫升無菌脫纖維羊血到安瓿瓶中,封口,置液氮或至40攝氏度冰箱中保存.
一般保存法
葡萄球菌、鏈球菌 18至24小時 血瓊脂斜面(高層加液體石蠟 4至8攝氏度 1至3個月
腸桿菌科 18至24小時 Soxbean酪蛋白瓊脂高層(加液體石蠟)4至8攝氏度 1年
腸桿菌科、非發(fā)酵菌、葡萄球菌等 18至24小時 牛肉湯(6份肉湯+4份丙三醇)或10%胰大豆肉湯或10%至15%甘油 至20攝氏度 6個月
苛養(yǎng)菌 18至24小時 5%小牛血清肉湯 至20攝氏度 6個月
分支桿菌 18至24小時 羅氏培養(yǎng)基(加液體石蠟)4至8攝氏度 3個月
幽門螺桿菌 18至24小時 心腦浸出液或布氏肉湯加入甘油 至70攝氏度 6年
注：待保存菌均需培養(yǎng)18至24小時.
葡萄球菌 18至24 4 1個月,加石蠟油3個月
腸桿菌科 18至24 4 1個月,加石蠟油3個月
非發(fā)酵菌 18至24 4 1個月,加石蠟油3個月
其他細菌 18至24 4 1個月,加石蠟油3個月
日常用的標準菌株應保存于胰大豆瓊脂平皿(非苛養(yǎng)菌)或營養(yǎng)豐富的巧克力瓊脂平皿(苛養(yǎng)菌),4至8攝氏度保存,每周傳代1次.
每次使用前應把菌株傳代到相應的平皿上或使其獲得單個菌落.
厭氧菌保存
短期保存法
皰肉培養(yǎng)基保存法：用牛肉渣和牛肉浸出液制成皰肉培養(yǎng)管,接種待保存菌株,然后在液體表面覆蓋1至50px的石蠟,再將培養(yǎng)基垂直放置片刻,待石蠟凝固置35攝氏度培養(yǎng)(無芽孢厭氧培養(yǎng)72小時,普通梭菌培養(yǎng)24小時,產期莢膜梭菌和多枝梭菌培養(yǎng)2周左右),最后置室溫或至20攝氏度保存.發(fā)酵糖類的厭氧菌每個月轉種1次,不發(fā)酵糖類的厭氧菌3至6個月轉種1次.
半固體培養(yǎng)基保存法：在上述液體培養(yǎng)基中加入0.2%至0.5%瓊脂,制成半固體培養(yǎng)基,接種時用毛細管將待保存的厭氧菌的菌液加入半固體培養(yǎng)管底,表面加入1至50px厚度的液體石蠟,密封管口,35攝氏度培養(yǎng)48小時,置室溫或至20攝氏度保存.
丙三醇乳劑培養(yǎng)基保存法在厭氧菌液體培養(yǎng)基(含胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、L半胱氨酸和維生素k等)中加入少量牛肉渣分裝于長試管中,接種待保存菌株,置35攝氏度培養(yǎng)48至72小時,取出后加入無菌丙三醇(按1:1比例),蓋緊蓋子后用石蠟封口,置4攝氏度或至20攝氏度保存.此法適用于保存脆弱擬桿菌、產黑色素普雷沃菌和具核梭桿菌.
長期保存法
低溫冷凍保存法
厭氧菌在低溫條件下新陳代謝處于抑制狀態(tài),不繁殖也不死亡.培養(yǎng)基包括脫纖維羊血、兔血或馬血,20%脫脂牛乳,7.5%葡萄糖的馬血清.
將待保存菌株(培養(yǎng)24至48小時)加入上述培養(yǎng)基中,封好瓶口,置至70攝氏度液氮或至70攝氏度低溫冰箱中保存.菌種不同,保存時間也有差異,最長可保存10年,最短可保存2年以上.
冷凍真空干燥法
冷凍真空干燥法的培養(yǎng)基(保存劑)有以下2種.10%至20%脫脂牛奶加入0.1%的谷氨酸鈉和0.03%的L至半胱氨酸,煮沸15min消毒,冷卻備用.2、10%蔗糖與馬血清的混合液,過濾滅菌,并置厭氧環(huán)境中預還原,分裝備用.
將培養(yǎng)基48小時左右(處于生長靜止期)的厭氧菌落或菌苔刮下,加入一定量的上述培養(yǎng)基,混勻分裝于安瓿中,置至20攝氏度低溫冰箱中迅速凍結,再放入冷凍干燥機內,抽真空16至24小時,然后將安瓿封口,置4攝氏度環(huán)境下長期保存.
冷凍干燥適合大多數(shù)厭氧菌的保存,可保存數(shù)月或數(shù)年.
真菌菌種保存
冰凍保存法
冰凍保存有助于抑制真菌,尤其是抑制皮膚癬菌發(fā)生多形性變化,即變異(當其培養(yǎng)物變成白色蓬松絨毛狀時,真菌就失去所有特征性的顏色及形態(tài)學特征,會停止產生各種孢子,由此會導致菌種鑒定困難).
真菌接種在沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)8至10日或甚至見到菌落將近要覆蓋全面培養(yǎng)基時,將試管置于至20攝氏度冰箱中保存.
石蠟油保存法
這是一種簡單、經濟、可靠性高的保存真菌培養(yǎng)物的方法.
真菌接種于沙氏瓊脂上,25攝氏度培養(yǎng),酵母菌2至4日,產孢子的絲狀真菌需形成成熟的孢子,不產孢子的真菌生長成健壯的菌絲為止.覆蓋50px的無菌石蠟(礦物)油(石蠟油的滅菌一般在1小時以上).然后將自然冷卻的石蠟油加入含真菌的試管中,使液面高于斜面頂部25px左右.使用此方法,許多真菌可在室溫下存活多年.
在恢復培養(yǎng)時,先從石蠟油下面挑取小塊2至3毫米菌落,沿試管壁邊挑取邊擠壓過多的石蠟油(因石蠟油過多會抑制真菌生長),然后接種于沙氏瓊脂斜面上,培養(yǎng)數(shù)日并觀察生長情況.
水保存法
水保存法是一種最簡單、最經濟的方法.將真菌接種于培養(yǎng)基斜面上,待培養(yǎng)成熟后,將無菌蒸餾水直接注于試管中,沖洗下孢子和菌絲,再轉入無菌小試管中,密封瓶口,貼好標簽,存放在室溫或4攝氏度即可.利用此管保存菌株,簡單易行,經濟、效果好.在恢復培養(yǎng)時,取懸液接種于SDA培養(yǎng)基即可.大多數(shù)真菌均可用這種方法保存數(shù)年(最長12年).