環(huán)境工程微生物學(xué)微生物的純培養(yǎng)技術(shù)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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[pure culture]是指在同一培養(yǎng)物或一管菌種中，所有的細(xì)胞或孢子都是生物分類中的同一個(gè)種。嚴(yán)格說(shuō)，是在培養(yǎng)基上由一個(gè)細(xì)胞分裂，繁殖所產(chǎn)生的后代。
自然界的微生物均混雜存在，為獲得某種微生物，需采取一系列措施將其從混雜菌群中分離為純培養(yǎng)；由于周圍環(huán)境，空氣，用具，操作者體表均有大量微生物存在，為獲得和保持純培養(yǎng)，在分離，培養(yǎng)過(guò)程中，必需嚴(yán)格操作，以防止雜菌污染。純培養(yǎng)技術(shù)包括滅菌，消毒技術(shù)和分離接種過(guò)程的無(wú)菌操作技術(shù)。
培養(yǎng)基，器皿，接種工具的徹底滅菌，環(huán)境及某些材料的消毒，是防止雜菌污染，保證純培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟。常用方法如下。
干熱滅菌 通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)變性或凝固，或直接燒死菌體。又分為：
1，燒灼滅菌：直接用火焰燒灼用具上的雜菌，如接種時(shí)在火焰上灼燒接種工具，試管口，瓶口等，或焚燒廢棄的帶菌物品。
2，烘箱滅菌：玻璃器皿，接種用具，手術(shù)器械經(jīng)包裝后，放電熱干燥箱中，升溫至160-170，1-2小時(shí)，可徹底殺滅雜菌。滅菌后的物品保持干燥，帶包裝存放備用，不易污染。
但應(yīng)注意溫度及時(shí)間均不可超過(guò)上述規(guī)定，否則包裝紙被烤焦，不宜使用。
濕熱滅菌 直接煮沸或用飽和水蒸汽的高溫進(jìn)行滅菌或消毒。常用的方法有高壓蒸汽滅菌，間歇滅菌，巴斯德滅菌，煮沸消毒等。
1，高壓蒸汽滅菌[autoclaving]：亦稱飽和蒸汽滅菌。是醫(yī)療保健，發(fā)酵工業(yè)及微生物實(shí)驗(yàn)，科研中常用的滅菌方法。利用水的沸點(diǎn)隨水蒸汽的壓力增加而上升所產(chǎn)生的高溫，達(dá)到滅菌的目的。常用的滅菌裝置為高壓滅菌鍋，是用鋁，鐵等金屬制成的可密閉容器，可承受一定壓力[一般耐壓為5公斤/厘米2]，分為手提式，立式及臥式等。加熱后鍋底的水不斷產(chǎn)生蒸汽，待冷空氣排除后，使完全密閉，溫度即可隨蒸汽壓力而上升。常用于培養(yǎng)基，水等滅菌，1.05公斤/厘米22[15磅/英寸]，即溫度121，15-20分鐘即可。使用高壓鍋在升壓前必須充分排除冷空氣，才能保證壓力上升與溫度上升相一致；到達(dá)所需壓力[溫度]必須保持恒溫，到達(dá)恒溫時(shí)間后，切斷電源，待壓力緩緩下降至零點(diǎn)，方可排汽，開(kāi)蓋。
2，間歇滅菌：在沒(méi)有高壓滅菌鍋時(shí)，采用常壓間歇蒸煮的方法滅菌。即將待滅菌的培養(yǎng)基等放在蒸鍋內(nèi)，經(jīng)100?熱蒸汽蒸3次，每次30-60分鐘。第一，二次蒸后放25-30?恒溫過(guò)夜，以使未殺死的芽孢萌發(fā)，待第三次蒸后，即可達(dá)到滅菌的目的。但此法較麻煩，且會(huì)使培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分破壞，在設(shè)備允許的情況下，不宜采用。
3，巴斯德滅菌：由巴斯德首創(chuàng)。即在60條件下保持30分鐘，可殺死致病微生物而保持營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。因僅殺死致病微生物，故又稱巴氏消毒法。常用于牛乳，啤酒等食品的消毒。
4，煮沸消毒：把物品直接放在清水中煮沸，5分鐘以上可殺死全部營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，15-20分鐘或在水中加入1％碳酸鈉，效果更佳。用于帶菌物品，器皿的初步清洗。 接種室，接種箱的滅菌和消毒
1，紫外光照射：一般實(shí)驗(yàn)室使用30瓦紫外光燈，距桌面約1米，工作前清洗桌面，照射20-30分鐘即可保持無(wú)菌狀態(tài)。使用紫外燈滅菌，一定要在工作開(kāi)始前關(guān)閉，以免損傷皮膚及粘膜。 2，化學(xué)藥劑消毒：接種室及接種箱使用前后均需用2-3％來(lái)蘇水或5％石炭酸擦洗及噴灑，以增強(qiáng)紫外線的殺菌效果。 3，硫磺或甲醛熏蒸：較大的接種空間，可用硫磺熏蒸。用量為每平方米空間3-4克。熏蒸前先將地面及墻面噴灑少量水，將硫磺放金屬器皿中再加熱。甲醛熏蒸需用高錳酸鉀做氧化劑。通常每立方米空間用6-8毫升40％甲醛[市售福爾馬林]，4-5克高錳酸鉀。室內(nèi)打掃擦凈后，將高錳酸鉀放在容器中[玻璃，陶瓷器皿]，然后倒入甲醛[不必加熱]。
以上熏蒸均刺激呼吸道，眼等處，操作者應(yīng)迅速離開(kāi)，過(guò)夜后方能入室工作。
[aseptic technigue]培養(yǎng)基，器皿，用具等經(jīng)滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境中[接種室，接種箱]將含菌材料接種到培養(yǎng)基上的操作過(guò)程，即無(wú)菌接種操作。 接種是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究及生產(chǎn)的關(guān)鍵，嚴(yán)格的無(wú)菌接種操作，才能保證上述各項(xiàng)工作順利進(jìn)行，否則將導(dǎo)致雜菌污染，工作失敗甚至純種丟失。
試管斜面接種操作示意 接種環(huán)的火焰滅菌[1]左手夾住試管[2]灼燒接種環(huán)[3]拔出棉塞，夾在小指，無(wú)名指上，管口過(guò)火[4]取菌，接種，接種后在火焰上方迅速塞好棉
塞 無(wú)菌操作技術(shù)的掌握需經(jīng)嚴(yán)格訓(xùn)練，具體方法需在實(shí)踐中學(xué)習(xí)，以下僅說(shuō)明操作要點(diǎn)。
1，進(jìn)行無(wú)菌檢查：培養(yǎng)基，器皿等使用前應(yīng)抽樣檢查。將無(wú)菌培養(yǎng)基抽樣置37培養(yǎng)2天，觀察有無(wú)雜菌生長(zhǎng)。在培養(yǎng)皿中倒入熔化的固體培養(yǎng)基，冷凝后放同樣條件下培養(yǎng)及觀察。 在接種室[箱]中定期用固體培養(yǎng)基倒平板，打開(kāi)皿蓋5分鐘，加蓋后放溫箱中培養(yǎng)。在滅菌前后各做2-3個(gè)平板，觀察接種室[箱]污染及滅菌情況，做到心中有數(shù)。
2，操作過(guò)程建立無(wú)菌概念，注意防止雜菌污染：已滅菌的培養(yǎng)基，器皿使用中應(yīng)注意保持無(wú)菌，不可隨意打開(kāi)皿蓋；瓶[管]口的棉塞及移液管等，使用前均不可暴露在空氣中甚至棄置桌面。取放試管培養(yǎng)基時(shí)，切勿平放或倒置，以免棉塞被沾濕，導(dǎo)致污染。在氣流小的情況下，空氣中的雜菌也可隨灰塵落下，故接種時(shí)管口，瓶口，培養(yǎng)皿等均不可垂直暴露，應(yīng)充分利用酒精燈火焰周圍的無(wú)菌區(qū)，操作應(yīng)迅速，準(zhǔn)確。
3，注意保持無(wú)菌環(huán)境：接種中凡使用過(guò)的帶菌用具，器皿，如移液管，試管，菌液等，不可隨手棄置桌上，應(yīng)浸泡在5％來(lái)蘇水中或置放在固定的容器中。接種環(huán)等接種工具，在每管接種前后均應(yīng)充分灼燒滅菌，否則將直接導(dǎo)致雜菌污染。