微生物學(xué)實驗技術(shù)——體外抑菌試驗
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
無菌檢測培養(yǎng)皿
體外抑菌試驗
抑菌試驗用于測定抗菌藥物體外抑制細(xì)菌生長效力的試驗稱為抑菌試驗.通過抑菌實驗,可以測定一個藥物的最低抑菌濃度,用以評價該藥物的抑菌性能,這是抗菌藥物的最基本的藥效學(xué)數(shù)據(jù).主要方法有進(jìn)行定性測定的擴散法(如抑菌斑試驗)和進(jìn)行定量測定的稀釋法(如最低抑菌濃度實驗).
1.常量肉湯稀釋法
抗菌藥物貯存液制備
抗菌藥物貯存液濃度不應(yīng)低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高測定濃度.溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度.抗菌藥物直接購自廠商或相關(guān)機構(gòu).所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進(jìn)行計算.例如：需配制100ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液,所用抗生素為粉劑,其藥物的有效力為750μg/mg.用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6mg.根據(jù)公式計算所需稀釋劑用量為：(182.6mg×750μg/ml)/1280μg/ml=107.0ml,然后將182.6mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中.制備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5.配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-60℃以下環(huán)境,保存期不超過6個月.
藥敏試驗用抗菌藥物濃度范圍
根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標(biāo)準(zhǔn),藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥,中介和敏感分界點值,特殊情況例外.
NCCLS推薦使用Mueller-Hinton(MH)肉湯,pH7.2~7.4.需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好.在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時,應(yīng)在肉湯中加入2%(W/V)氯化鈉,按制造廠家的要求配制需要量的MH肉湯.嗜血桿菌屬菌使用HTM肉湯,肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯.
接種物的制備
有2種方法配制接種物,一是細(xì)菌生長方法,用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3-5個,接種于4-5ml的水解酪蛋白(MH)肉湯中,35℃孵育2-6h.增菌后的對數(shù)生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn),約含1~2×108CFU/ml.二是直接菌落懸液配制法,對某些苛養(yǎng)菌,如流感嗜血桿菌,淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株,推薦直接取培養(yǎng)18~24h的菌落調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液.用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶100稀釋后備用.注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物,并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng),以檢查接種物純度.
注：在臨床微生物學(xué)檢驗中,麥?zhǔn)媳葷岱ǔＳ糜诩?xì)菌鑒定,藥敏實驗前配置菌液時大致判斷菌液濃度的一種方法,通常認(rèn)為,如將配菌液濃度配成0.5麥?zhǔn)媳葷峁軙r,相當(dāng)于1.5×108細(xì)菌數(shù)/ml,由于方法本身就是一種估計的方法,所以盡管不同細(xì)菌大小差異很大,除了真菌孢子,細(xì)菌的差別不大,結(jié)果不會有影響.但是,標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濃度,是藥敏實驗結(jié)果的影響因素之一.
附：0.5麥?zhǔn)媳葷峁芘渲品椒?/span>
0.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2.2H2O)0.5ml0.36NH2SO4(1%,V/V)99.5ml
將二液混合,置螺口試管中,放室溫暗處保存.用前混勻.有效期為6個月.
稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種
取無菌試管(13×100mm)13支,排成一排,除第1管加入1.6mlMH肉湯外,其余每管加入MH肉湯1ml,在第1管加入抗菌藥物原液(如1280μg/ml)0.4ml混勻,然后吸取1ml至第2管,混勻后再吸取1ml至第3管,如此連續(xù)倍比稀釋至第11管,并從第11管中吸取1ml棄去,第12管為不含藥物的生長對照.此時各管藥物濃度依次為256,128,64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25μg/ml.然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml,使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml.第1管至第11管藥物濃度分別為128,64,32,16,8,4,2,1,05,0.25,0.125μg/ml.
孵育
將接種好的稀釋管塞好塞子,置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌應(yīng)持續(xù)孵育滿24h.
結(jié)果判斷與解釋
在讀取和報告所測試菌株的MIC前,應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好,同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染,質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍.以肉眼觀察,藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者,即為受試菌的MIC.甲氧芐胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法終點判斷,與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長管藥物濃度為受試菌MIC.
根據(jù)NCCLS推薦的分界點值標(biāo)準(zhǔn),判斷耐藥(resistant,R),敏感(susceptible,S)或中介(intermediate,
I).S表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效,禁忌癥除外.R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內(nèi)或血液中所達(dá)到的濃度所抑制,或?qū)儆诰哂刑囟退帣C理(如β-內(nèi)酰胺酶),所以臨床治療效果不佳.I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度,療效低于敏感菌.還表示被測菌株可以通過提高劑量(如β-內(nèi)酰胺類藥物)被抑制,或在藥物生理性濃集的部位(如尿液)被抑制.另外,中介還作為“緩沖域”,以防止由微小的技術(shù)因素失控,所導(dǎo)致較大的錯誤解釋.
2.微量肉湯稀釋法
抗菌藥物和培養(yǎng)基制備同常量肉湯稀釋法.
MIC板制備
無菌操作,將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中,第1至第11孔加藥液,每孔10μl,第12孔不加藥作為生長對照,冰凍干燥后密封,-20℃以下保存?zhèn)溆?
接種物制備
將用生長法或直接菌懸液法制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液,經(jīng)MH肉湯1∶1000稀釋后,向每孔中加100μl,密封后置35℃普通空氣孵箱中,孵育16~20h判斷結(jié)果.當(dāng)試驗嗜血桿菌屬,鏈球菌屬時,孵育時間為20~24h,試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古霉素的藥敏試驗時孵育時間必須滿24h.此時,第1孔至第11孔藥物濃度分別為128,64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25,0.125μg/ml.
結(jié)果判斷
結(jié)果判斷
以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC.當(dāng)陽性對照孔(即不含抗生素)內(nèi)細(xì)菌明顯生長試驗才有意義.當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時,應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度.如出現(xiàn)多處跳孔,則不應(yīng)報告結(jié)果,需重復(fù)試驗.通常對革蘭陰性桿菌而言,微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結(jié)果相同或低一個稀釋度(1孔或2倍).
瓊脂稀釋法
瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物,加入融化并冷至50℃左右的定量MH瓊脂中,制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板,接種受試菌,孵育后觀察細(xì)菌生長情況,以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC.本法優(yōu)點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定,結(jié)果可靠,易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點是制備含藥瓊脂平板費時費力.
培養(yǎng)基制備
使用MH瓊脂,按商品說明書進(jìn)行配制,pH7.2~7.4.淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎(chǔ)加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%(V/V)綿羊血的MH瓊脂(當(dāng)試驗磺胺藥時,使用溶解的馬血).
含藥瓊脂平板制備
根據(jù)實驗設(shè)計,將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解,并在45~50℃水浴中平衡的MH瓊脂中,充分混勻傾倒滅菌平皿,瓊脂厚度3~4mm.通常按1∶9比例配制藥物瓊脂平板,根據(jù)需要來選擇藥物濃度范圍.配制好的含藥瓊脂平板應(yīng)裝入密封塑料袋中,置2~8℃冰箱可貯存5天.
接種物制備與接種
制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液,再1∶10稀釋,以多點接種器吸取制備好菌液(約1~2μl)接種于瓊脂平板表面,每點菌數(shù)約為104CFU,形成直徑為5~8mm的菌斑.接種好后置35℃孵育16~20h(甲氧西林耐藥葡萄球菌,萬古霉素耐藥腸球菌孵育時間應(yīng)滿24h),觀察結(jié)果.奈瑟菌屬,鏈球菌屬細(xì)菌置5%二氧化碳,幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育.
結(jié)果判斷
將平板置于暗色,無反光物體表面上判斷試驗終點,以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC.在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見輕微細(xì)菌生長,與生長對照比較抑制80%以上細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為終點濃度.
如果出現(xiàn)有2個以上菌落生長于含藥濃度高于終點水平的瓊脂平板上,或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現(xiàn)象,則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗.
紙片擴散法(K-B法)
紙片擴散法(K-B法)又稱瓊脂擴散法K-B法藥敏試驗時接種物配制有兩種方法.
第一種是肉湯增菌法(對數(shù)生長法),是用接環(huán)挑取3-5個細(xì)菌菌落入肉湯增菌管中進(jìn)行增菌4-6小時,然后用生理鹽水或肉湯對增菌管中的培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋校正使其濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(因為經(jīng)過增菌培養(yǎng)其培養(yǎng)物濃度一般都高于此標(biāo)準(zhǔn)).
第二種方法是直接菌落法：從孵育18-24小時的非選擇性培養(yǎng)基上,挑取3-5菌落,直接用肉湯或鹽制成懸液作為接種,然后將濁度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn).此法是檢測苛養(yǎng)菌(如嗜血桿菌,淋病奈瑟菌和鏈球菌)和潛在的對甲氧西林耐藥的葡萄球菌的推薦方法.
將菌制成菌懸液用無菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多余菌液,涂布整個M2H平板表面,反復(fù)3次,每次將平板旋轉(zhuǎn)60度,保證涂布均勻,35℃培養(yǎng)后菌落呈半融合狀態(tài),否則影響藥敏結(jié)果.
K-B法指定用M-H瓊脂平板,應(yīng)用直徑90cm平皿,在水平的無菌臺上傾倒,準(zhǔn)確量取高壓滅菌后的M2H瓊脂液25ml,使之瓊脂板厚度為4mm.否則厚度過高,使含藥物紙片的藥物半球形擴散的體積加大,導(dǎo)致假耐藥;反之導(dǎo)致假敏感.
要求紙片直徑6.00～6.35mm,每片吸水量約12μl,紙片的藥物含量必須與K2B法規(guī)定的一致,用前必須做質(zhì)量鑒定,質(zhì)量合格方可使用.
紙片的保存尤為重要,一般要求保存在有干燥劑的容器內(nèi)低溫保存,紙片取出后須放室溫10min后方可打開,否則空氣中的水份冷凝在紙片上易潮解,使藥物失效影響藥敏試驗結(jié)果.
E試驗(E-test)
E試驗是指濃度梯度瓊脂擴散試驗,其原理基本同擴散法,即濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中擴散,在試條周圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長被抑制,從而形成透明的抑菌圈.E試驗綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點,同時還彌補了二者的一些不足,可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌藥物對受試菌的MIC.
培養(yǎng)基,菌液制備和接種同紙片擴散法.
貼E試驗條
同紙片擴散法,E試驗條的刻度面朝上,不得貼反,一旦接觸瓊脂后不得再移動.直徑150mm的平皿內(nèi)可放置6根E試驗試條,90mm者一般只能放置1根.
孵育時間和溫度同紙片擴散法.
結(jié)果閱讀
孵育后圍繞試條可形成一個橢圓形的抑菌圈,在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數(shù)刻度即是測定抗菌藥物對受試菌的MIC.閱讀時應(yīng)注意的問題見供應(yīng)商的產(chǎn)品說明書.