食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)的檢驗(yàn)方法.
本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎腸桿菌的檢驗(yàn).
2設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2.1恒溫培養(yǎng)箱:25±1,36±1,44±0.5.
2.2冰箱:2至5.
2.3恒溫水浴箱:44±0.5.
2.4天平:感量0.1克.
2.5均質(zhì)器.
2.6振蕩器.
2.7無菌吸管:1毫升(具0.01毫升刻度)、10毫升(具0.1毫升刻度)或微量移液器及吸頭.
2.8無菌錐形瓶:容量100毫升、200毫升、2000毫升.
2.9無菌培養(yǎng)皿:直徑90毫米.
2.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙.
2.11全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng).
3培養(yǎng)基和試劑
3.1緩沖蛋白胨水(bufferpeptonewater,BPW):見附錄A中A.1.
3.2改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium,毫升ST-Vm):見附錄A中A.2.
3.3阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基.
3.4胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticasesoyagar,TSA):見附錄A中A.3.
3.5生化鑒定試劑盒.
3.6氧化酶試劑:見附錄A中A.4.
3.7L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基:見附錄A中A.5.
3.8L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基:見附錄A中A.6.
3.9L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基:見附錄A中A.7.
3.10糖類發(fā)酵培養(yǎng)基:見附錄A中A.8.
3.11西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基:見附錄A中A.9.
第一法阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)
4檢驗(yàn)程序
阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序見圖1.
5操作步驟
5.1前增菌和增菌
取檢樣100克(毫升)加入已預(yù)熱至44裝有900毫升緩沖蛋白胨水的錐形瓶中,用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解,36±1培養(yǎng)18h±2小時(shí).移取1毫升轉(zhuǎn)種于10毫升毫升ST-Vm肉湯,44±0.5培養(yǎng)24h±2小時(shí).
5.2分離
5.2.1輕輕混勻毫升ST-Vm肉湯培養(yǎng)物,各取增菌培養(yǎng)物1環(huán),分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板,36±1培養(yǎng)24h±2小時(shí).
5.2.2挑取1個(gè)～5個(gè)可疑菌落,劃線接種于TSA平板.25±1培養(yǎng)48h±4h.
5.3鑒定
自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落,進(jìn)行生化鑒定.阪崎腸桿菌的主要生化特征見表1.可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng).
第二法阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)
7操作步驟
7.1樣品的稀釋
7.1.1固體和半固體樣品:無菌稱取樣品100克、10克、1克各三份,加入已預(yù)熱至44分別盛有900毫升、90毫升、9毫升BPW中,輕輕振搖使充分溶解,制成1:10樣品勻液,置36±1培養(yǎng)18h±2小時(shí).分別移取1毫升轉(zhuǎn)種于10毫升毫升ST-Vm肉湯,44±0.5培養(yǎng)24h±2小時(shí).
7.1.2液體樣品:以無菌吸管分別取樣品100毫升、10毫升、1毫升各三份,加入已預(yù)熱至44分別盛有900毫升、90毫升、9毫升BPW中,輕輕振搖使充分混勻,制成1:10樣品勻液,置36±1培養(yǎng)18h±2小時(shí).分別移取1毫升轉(zhuǎn)種于10毫升毫升ST-Vm肉湯,44±0.5培養(yǎng)24h±2小時(shí).
7.2分離、鑒定
同5.2,5.3.
8結(jié)果與報(bào)告
綜合菌落形態(tài)、生化特征,根據(jù)證實(shí)為阪崎腸桿菌的陽性管數(shù),查MPN檢索表,報(bào)告每100克(毫升)樣品中阪崎腸桿菌的MPN值(見附錄Ｂ中表B.1)
附錄A
(規(guī)范性附錄)
培養(yǎng)基和試劑
A.1緩沖蛋白胨水(BPW)
A.1.1成分
蛋白胨10.0克
氯化鈉5.0克
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)9.0克
磷酸二氫鉀1.5克
蒸餾水1000毫升
pH7.2
A.1.2制法
加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)pH,121高壓滅菌15分鐘.
A.2改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium,毫升ST-Vm)
A.2.1改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(毫升ST)肉湯
A.2.1.1成分
氯化鈉34.0克
胰蛋白胨20.0克
乳糖5.0克
磷酸二氫鉀2.75克
磷酸氫二鉀2.75克
十二烷基硫酸鈉0.1克
蒸餾水1000毫升
pH6.8±0.2
A.2.1.2制法
加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)pH.分裝每管10毫升,121高壓滅菌15分鐘.
A.2.2萬古霉素溶液
A.2.2.1成分
萬古霉素10.0m克
蒸餾水10.0毫升
A.2.2.2制法
10.0m克萬古霉素溶解于10.0毫升蒸餾水,過濾除菌.萬古霉素溶液可以在0至5保存15天.
A.2.3改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium,毫升ST-Vm)
每10毫升毫升ST加入萬古霉素溶液0.1毫升,混合液中萬古霉素的終濃度為10μ克/毫升.
注:毫升ST-Vm必須在24h之內(nèi)使用.
A.3胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)
A.3.1成分
胰蛋白胨15.0克
植物蛋白胨5.0克
氯化鈉5.0克
瓊脂15.0克
蒸餾水1000毫升
pH7.3±0.2
A.3.2制法
加熱攪拌至溶解,煮沸1分鐘,調(diào)節(jié)pH,121高壓15分鐘.
A.4氧化酶試劑
A.4.1成分
N,N,N',N'-四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.0克
蒸餾水100毫升
A.4.2制法
少量新鮮配制,于冰箱內(nèi)避光保存,在7d之內(nèi)使用.
A.4.3試驗(yàn)方法
用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落,涂布在氧化酶試劑濕潤(rùn)的濾紙平板上.如果濾紙?jiān)?0s之內(nèi)未變?yōu)樽霞t色、紫色或深藍(lán)色,則為氧化酶試驗(yàn)陰性,否則即為氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性.
注:實(shí)驗(yàn)中切勿使用鎳/鉻材料.
A.5L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基
A.5.1成分
L-賴氨酸鹽酸鹽(L-lysinemonohydrochloride)5.0克
酵母浸膏3.0克
葡萄糖1.0克
溴甲酚紫0.015克
蒸餾水1000毫升
pH6.8±0.2
A.5.2制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH.每管分裝5毫升,121高壓15分鐘.
A.5.3實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下.30±1培養(yǎng)24h±2小時(shí),觀察結(jié)果.L-賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性者,培養(yǎng)基呈紫色,陰性者為黃色.
A.6L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基
A.6.1成分
L-鳥氨酸鹽酸鹽(L-ornithinemonohydrochloride)5.0克
酵母浸膏3.0克
葡萄糖1.0克
溴甲酚紫0.015克
蒸餾水1000毫升
pH6.8±0.2
A.6.2制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH.每管分裝5毫升.121高壓15分鐘.
A.6.3實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下.30±1培養(yǎng)24h±2小時(shí),觀察結(jié)果.L-鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性者,培養(yǎng)基呈紫色,陰性者為黃色.
A.7L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基
A.7.1成分
L-精氨酸鹽酸鹽(L-ar克ininemonohydrochloride)5.0克
酵母浸膏3.0克
葡萄糖1.0克
溴甲酚紫0.015克
蒸餾水1000毫升
pH6.8±0.2
A.7.2制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH.每管分裝5毫升.121高壓15分鐘.
A.7.3實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于L-精氨酸脫羧酶培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下.30±1培養(yǎng)24h±2小時(shí),觀察結(jié)果.L-精氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性者,培養(yǎng)基呈紫色,陰性者為黃色.
A.8糖類發(fā)酵培養(yǎng)基
A.8.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A.8.1.1成分
酪蛋白(酶消化)10.0克
氯化鈉5.0克
酚紅0.02克
蒸餾水1000毫升
pH6.8±0.2
A.8.1.2制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH.每管分裝5毫升.121高壓15分鐘.
A.8.2糖類溶液(D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙)
A.8.2.1成分
糖8.0克
蒸餾水100毫升
A.8.2.2制法
分別稱取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖類成分各8克,溶于100毫升蒸餾水中,過濾除菌,制成80m克/毫升的糖類溶液.
A.8.3完全培養(yǎng)基
A.8.3.1成分
基礎(chǔ)培養(yǎng)基875毫升
糖類溶液125毫升
A.8.3.2制法
無菌操作,將每種糖類溶液加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基,混勻；分裝到無菌試管中,每管10毫升.
A.8.4實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于各種糖類發(fā)酵培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下.30±1培養(yǎng)24h±2小時(shí),觀察結(jié)果.糖類發(fā)酵試驗(yàn)陽性者,培養(yǎng)基呈黃色,陰性者為紅色.
A.9西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基
A.9.1成分
檸檬酸鈉2.0克
氯化鈉5.0克
磷酸氫二鉀1.0克
磷酸二氫銨1.0克
硫酸鎂0.2克
溴百里香酚藍(lán)0.08克
瓊脂8.0克～18.0克
蒸餾水1000毫升
pH6.8±0.2
A.9.2制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH.每管分裝10毫升,121高壓15分鐘,制成斜面.
A.9.3實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于整個(gè)培養(yǎng)基斜面,36±1培養(yǎng)24h±2小時(shí),觀察結(jié)果.陽性者培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色.