菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
作者：
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菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法
菌落總數(shù)介紹:
菌落是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼識(shí)別的生長(zhǎng)物,它是由數(shù)以萬計(jì)相同的細(xì)菌集合而成.當(dāng)樣品被稀釋到一定程度,與培養(yǎng)基混合,在一定培養(yǎng)條件下,每個(gè)能夠生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌細(xì)胞都可以在平板上形成一個(gè)可見的菌落.
菌落總數(shù)就是指在一定條件下(如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等)每克(每毫升)檢樣所生長(zhǎng)出來的細(xì)菌菌落總數(shù).按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定,即在需氧情況下,37攝氏度培養(yǎng)48h,能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落總數(shù),所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌,由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求,故難以繁殖生長(zhǎng).因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù),菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類,所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù),需氧菌數(shù)等.
菌落總數(shù)測(cè)定是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量,它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求,以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià).菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣.
檢驗(yàn)方法
菌落總數(shù)的測(cè)定,一般將被檢樣品制成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液,然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1毫升置于滅菌平皿中與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合,在一定溫度下,培養(yǎng)一定時(shí)間后(一般為48小時(shí)),記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數(shù)量,依據(jù)稀釋倍數(shù),計(jì)算出每克(或每毫升)原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù).
基本操作一般包括:樣品的稀釋,傾注平皿,培養(yǎng)48小時(shí),計(jì)數(shù)報(bào)告.
國(guó)內(nèi)外菌落總數(shù)測(cè)定方法基本一致,從檢樣處理、稀釋、傾注平皿到計(jì)數(shù)報(bào)告無何明顯不同,只是在某些具體要求方面稍有差別,如有的國(guó)家在樣品稀釋和傾注培養(yǎng)進(jìn),對(duì)吸管內(nèi)液體的流速,稀釋液的振蕩幅度、時(shí)間和次數(shù)以及放置時(shí)間等均作了比較具體的規(guī)定.
說明
(一)樣品的處理和稀釋:
操作方法:以無菌操作取檢樣25g(或25毫升),放于225毫升滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振要或研磨制成1:10的均勻稀釋液.
固體檢樣在加入稀釋液后,最好置滅菌均質(zhì)器中以8000至10000r/分鐘的速度處理1分鐘,制成1:10的均勻稀釋液.
用1毫升滅菌吸管吸取1:10稀釋液1毫升,沿管壁徐徐注入含有9毫升滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混合均勻,制成1:100的稀釋液.
另取1毫升滅菌吸管,按上項(xiàng)操作順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋一次即換用1支1毫升滅菌吸管.
無菌操作:操作中必須有“無菌操作”的概念,所用玻璃器皿必須是完全滅菌的,不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì).所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理.樣品如果有包裝,應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣.
操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行.瓊脂平板在工作臺(tái)暴露15分鐘,每個(gè)平板不得超過15個(gè)菌落.
采樣的代表性:如系固體樣品,取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn),宜多采幾個(gè)部位.固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨,液體樣品須經(jīng)過振搖,以獲得均勻稀釋液.
樣品稀釋誤差:為減少樣品稀釋誤差,在連續(xù)遞次稀釋時(shí),每一稀釋液應(yīng)充分振搖,使其均勻,同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管.
在進(jìn)行連續(xù)稀釋時(shí),應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流入,勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi),以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi).
為減少稀釋誤差,SN標(biāo)準(zhǔn)采用取10毫升稀釋液,注入90毫升緩沖液中.
稀釋液:樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水,有的采用磷酸鹽緩沖液(或0.1％蛋白胨水),后者對(duì)食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用.如對(duì)含鹽量較高的食品(如醬油)進(jìn)行稀釋,可以采用滅菌蒸餾水.
(二)傾注培養(yǎng)
操作方法:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì),選擇2至3個(gè)適宜稀釋度,分別在制10倍遞增稀釋的同時(shí),以吸取該稀釋度的吸管移取1毫升稀釋液于滅菌平皿中,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿.
將涼至46攝氏度營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15毫升,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿,混合均勻.同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1毫升稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照.
待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平板,置36±1攝氏度溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h,取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),即得每克(每毫升)樣品所含菌落總數(shù).
傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46攝氏度水浴內(nèi)保溫,溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng),過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻.如無水浴,應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜.
傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一,從12至20毫升不等,一般以15毫升較為適宜,平板過厚可影響觀察,太薄又易于干裂.傾注時(shí),培基底部如有沉淀物,應(yīng)將底部棄去,以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察.
為使菌落能在平板上均勻分布,檢液加入平皿后,應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻,可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn),檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20分鐘,以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖..
培養(yǎng)溫度一般為37攝氏度(水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度,由于其生活環(huán)境水溫較低,故多采用30攝氏度).培養(yǎng)時(shí)間一般為48h,有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計(jì)數(shù).培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度,瓊脂平板培養(yǎng)48h后,培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15％.
為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆,不易分辨,可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板,不經(jīng)培養(yǎng),而于4攝氏度環(huán)境中放置,以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察.
在某些場(chǎng)合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培養(yǎng)后菌落呈紅色,易于分別.
(三)計(jì)數(shù)和報(bào)告
操作方法:培養(yǎng)到時(shí)間后,計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù).可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡檢查,以防遺漏.在記下各平板的菌落總數(shù)后,求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù),計(jì)算處原始樣品中每克(或每毫升)中的菌落數(shù),進(jìn)行報(bào)告.
到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間,應(yīng)立即計(jì)數(shù).如果不能立即計(jì)數(shù),應(yīng)將平板放置于0－4攝氏度,但不得超過24h.
計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在30至300之間的平板(SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25至250個(gè)菌落),若有二個(gè)稀釋度均在30至300之間時(shí),按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定,比值小于或等于2取平均數(shù),比值大于2則其較小數(shù)字(有的規(guī)定不考慮其比值大小,均以平均數(shù)報(bào)告).
若所有稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間.如均大于300,則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之.如均小于30,則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告之.如菌落數(shù)有的大于300,有的又小于30,但均不在30至300之間,則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之.如所有稀釋度均無菌落生長(zhǎng),則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之.有的規(guī)定對(duì)上述幾種情況計(jì)算出的菌落數(shù)按估算值報(bào)告.
不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比(同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近),即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少,稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多.如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)(有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,如酸性飲料等),不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù).
當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí),如呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無任何明顯界限,則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì),如存在有幾條不同來源的鏈,則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算,不要把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù).如有片狀菌落生長(zhǎng),該平板一般不宜采用,如片狀菌落不到平板一半,而另一半又分布均勻,則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù).
當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多(即所有稀釋度均大于300時(shí)),但分布很均勻,可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù).再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù).
菌落數(shù)的報(bào)告,按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1至100時(shí),按實(shí)有數(shù)字報(bào)告,如大于100時(shí),則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字,第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算.固體檢樣以克(g)為單位報(bào)告,液體檢樣以毫升(毫升)為單位報(bào)告,表面涂擦則以平方厘米(cm2)報(bào)告.
更多技術(shù)資料：日水生物培養(yǎng)基